[发明专利]基于单链RNA肽连接酶的JAK2基因特定突变检测试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种基于单链RNA肽连接酶的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变检测试剂盒及方法，是在指数扩增前就直接先对目标突变基因mRNA片段进行捕获富集，然后再对目标基因突变片段进行特异性扩增和检测的。JAK2基因g.[146452_146455delATGA]检测试剂盒主要包括：sRPlaseI连接酶，sRPlaseI连接酶缓冲液，RNase H酶，磁载多肽Ps，短DNA片段P1和P2，引物Pn和Pm，其中sRPlaseI连接酶其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；检测方法主要包括杂交和RNase H酶消化、sRPlaseI酶连接和磁珠分离、特异性扩增这3部分。本发明提供的检测试剂盒和检测方法，具有特异性强和准确高效、简便经济的特点，可以有效检测出样本中含量低至1%的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变，可以应用于男性结直肠癌患者肺转移的预测和诊治中。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于单链RNA肽连接酶的JAK2基因g.[146452_146455delATGA]突变检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

基因是生物体的遗传物质，由其表达的蛋白质承担着生物体内的各项生命机能。基因发生变异或突变将导致生物体出现不同的生物特性或疾病状态。基因突变是基因在其分子结构上发生的核苷酸组成或排列顺序的改变，主要包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变这四种。基因突变和肿瘤的发生发展密切相关。目前，肿瘤已成为全世界范围内发病率和致死率最高的疾病。根据国家癌症中心2019年发布的数据显示，我国2015年新发癌症病例约392.9万例（平均每天超过1万人被确诊为癌症），死亡人数约233.8万例；近10多年来，我国癌症发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持约2.5％的增幅，给国人的生命健康造成了重大的威胁和沉重的负担。

在癌症诊治过程中常采用的血清肿瘤标志物和CT等检测手段具有局限性，首先其敏感性和特异性均不高，其次发现有异常时往往已是中晚期，最关键的是无法准确反映出癌灶的分子特征。癌症是一种基因疾病，其发生发展过程中涉及了各种基因突变，它是一个多基因突变累积的过程。因此解析癌症样本中存在的基因突变尤其是驱动基因等关键基因的特定突变，才能从分子本质上体现癌症的真实状况，这对于探究癌症的发生发展机制和预测癌症的发展变化，对于癌症的筛查和诊断，对于癌症的用药和治疗等方面都具有重要的意义。然而在癌症样本中，癌灶部分往往只占检材中的一部分，并且发生特定基因突变的癌细胞也只是癌灶中的一部分（癌灶的异质性），即癌症检测样本中常常存在着大量的野生型基因，尤其是在早癌样本中突变基因只占微小的比例，因此要从中准确有效地检测出特定的基因突变将具有很大的挑战性。

目前有多种分子技术可用于癌症基因突变的检测，如PCR-Sanger测序法、实时荧光定量PCR、扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）、数字PCR、变性高效液相色谱法（D-HPLC）以及二代测序（NGS）等方法。其中多数是基于PCR的方法，然而常规PCR扩增时无法区分野生型基因和突变基因，必需进行特定的设计或解析。如常规应用的PCR-Sanger测序法，就是扩增出特定基因片段，然后进行Sanger测序，利用测序峰图来分析特定基因位点的突变情况；再如商品化的ARMS技术，就是设计针对特定基因突变的扩增引物和检测探针，来实现特定基因突变的特异扩增和检测的；再如非常热门的二代测序技术，就是首先无区分地扩增特定基因片段，再利用二代测序超高通量的并行测序能力测出所有扩增基因片段，最后解析其中的突变。