[发明专利]一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒，包括鉴别试剂，所述的鉴别试剂包括十对引物中的至少一对与十条探针中的至少一条；本发明还提供了一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1根据基因库比对结核分枝杆菌复合群基因序列设计各个引物和探针；S2构建出结核分枝杆菌复合群的试剂盒程序；S3针对试剂盒程序的特异性和灵敏性试验；S4对建立的试剂盒程序进行多次重复试验；S5制备标准目的基因池；S6构建高灵敏度的特异性检测试剂盒；本发明的有益效果是：利用本发明所提供的基于特异性引物对和探针的试剂盒，可达到快速、全面检测鉴别结核杆菌，为后面的全面检测提供可能性；利用灵敏性测试、特异性测试和重复性测试，同时对比CT差值，达到快速准确检测。

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌检测试剂盒领域，具体是一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒及制备方法。

背景技术

结核病是全球重大传染病之一，而我国是全球结核病大国且在持续不断的增长，据统计，每3个人中就有1个人患有结核杆菌，目前受感染人数已远远超过了4亿人口，其中潜伏期患者达到90％-98％。该病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)等引起的一种慢性传染病，可遍布全身各个器官，多以肺部为主。

早在17000年前，有学者在野牛的遗骸中发现了结核分枝杆菌，是目前为止发现最早的结核起源[卢志明.半巢式自动实时荧光定量PCR检测在诊断肺内及肺外结核病应用价值研[D].山东：山东大学,2017.]。近7000年前，就已经在人身上发现结核分枝杆菌[1.Herrera L,et al.,saez-Nieto:Molecular analysis of rifampicin-resistantMycobacterium tuberculosis isolated in Spain(1996-2001).Description of newmutations in the rpoB gene and review of the literature[J].Int J AntimicrobAgents,2003,21:403-8.]。但人类的结核病是否起源于牛尚且没有明确的相关报道[2Huang H,et al.Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistantMycobacterum tuberculosis isolates in China[J].Tuberculosis(Edinb).2003.21:403-8]。直到1882年，Robert Koch分离得到结核病的病原菌结核分枝杆菌，为之后抗生素和疫苗的研制奠定了基础[1.Herrera L,et al.,saez-Nieto:Molecular analysis ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolated in Spain(1996-2001).Description of new mutations in the rpoB gene and review of the literature[J].Int J Antimicrob Agents,2003,21:403-8.][3Zhang M,Yue J,Yang Y,etal.Detection of mutation associated with Isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosis isolates from China[J].Clin Microbiol.2005,43:5477-82]。1906年，Albert Calmette和Camille Guerin成功研制出第一个抗结核病疫苗——卡介苗(BCG)，并于1921年在法国首次接种到人体上[Ramaswamy S,MusserJM.Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacteriumtuberculosis:1998update[J].Tuber Lung Dis.1998,79:3-29.]。1945年链霉素的问世，结核病得到了控制。随后，利福平、乙胺丁醇等药物开始用于治疗结核病，减少了全球肺结核患者死亡人数。特别是1952年异烟肼的出现，异烟肼具有杀菌能力强、副作用小，而且经济、便于服用等优点，异烟肼的预防性治疗10年内减少结核病人的发病率50％－60％。因此，20世纪80年代认为在20世纪末即可彻底消灭肺结核。但是，由于药物的滥用、HIV流行和耐药结核分枝杆菌的出现，使结核病在世界范围内再次增多。目前，全球约20亿人感染了结核分枝杆菌，2015年全球结核病报告中指出2014年全球新发病例约有960万，死亡病例大约有150万人，艾滋病和耐药结核分枝杆菌出现和流行导致全球结核病的发病率不断上升，这让结核病的预防、控制、诊断和治疗面临非常严峻的挑战。结核病已经成为全球性重要公共卫生问题之一，WHO 2015年公布的数据显示我国是全球结核病高负担国家之一，位居全球第三位，2015新增结核病例大约98万左右。