[发明专利]基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的引物，包括可扩增甲型流感病毒的第一引物组和可扩增乙型流感病毒的第二引物组，第一引物组包括SEQ ID.NO.3～4所示的第一内引物对、SEQ ID.NO.5～6所示的第一外引物对、SEQ ID.NO.7～8所示的第一环引物对；第二引物组包括SEQ ID.NO.9～10所示的第二内引物对、SEQ ID.NO.11～12所示的第二外引物对、SEQ ID.NO.13‑SEQ ID.NO.14所示的第二环引物对。所述引物能避免同一反应体系存在多组引物带来的引物与靶标的非特异性结合。本发明还提供了检测甲流和乙流病毒的探针、试剂盒及方法。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

呼吸道感染严重影响人们的身体健康，如2009年爆发的甲型H1NI流感病毒造成全球约数万人死亡，目前这类病毒仍在流行。目前对流感病毒的检测多是依赖于PCR扩增技术，但该技术通常需要昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，且存在耗时长、灵敏度低等缺点，不利于快速检测和应急检测。随着人们对于分子生物领域的不断深入研究，一种全新的核酸扩增技术—环介导恒温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)越来越受到研究人员的亲睐。该技术在操作便捷性、扩增效率、灵敏度、省时性等方面均高于PCR技术。但目前利用LAMP技术的流感病毒检测通常是利用一组引物，进而一次测试只能检测出一种流感病毒，而采用多组引物的相关研究较少，且易存在多组引物与靶标之间的非特异性结合等问题，导致检测结果的准确度不高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法，以在对样本的单次测试中同步实现对甲流和乙流病毒的简单、快速、特异性检测，克服了同一反应体系中多组引物同时存在带来的引物与靶标之间非特异性结合的问题。

第一方面，本发明提供了一种基于双重LAMP技术检测甲流和乙流病毒的探针，所述探针包括第一探针和第二探针，其中，所述第一探针包括如SEQ ID NO：1所示的第一核苷酸片段，所述第二探针包括如SEQ ID NO：2所示的第二核苷酸片段，所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，所述第一探针可以与甲型流感病毒的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第一荧光信号，所述第二探针可以与乙型流感病毒的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第二荧光信号，其中，所述第一荧光信号与所述第二荧光信号不同。

上述“所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团”可以理解为：所述第一核苷酸片段的5’端标记有第一荧光报告基团，3’端标记有第一荧光淬灭基团，所述第二核苷酸片段的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。

本发明所述第一探针、第二探针上标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团要相匹配，以使在目标核酸不存在或未扩增时，某一探针上标记的荧光报告基团发射的荧光信号会被其上标记的荧光淬灭基团所吸收。但要注意使上述第一荧光信号与第二荧光信号不同，以便区分出甲型、乙型流感病毒。

可选地，所述荧光报告基团包括羧基荧光素(FAM)、羧基-X-罗丹明(carboxy-X-rhodamine，ROX)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、花青素染料(Cyanines dyes)、德克萨斯红染料(Texas Red)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯-6-羧基荧光素(TET)和异硫氰酸荧光素(FITC)中的一种或多种，但不限于此。