[发明专利]基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的探针，其特征在于，所述探针包括第一探针和第二探针，其中，所述第一探针包括如SEQ ID NO：1所示的第一核苷酸片段，所述第二探针包括如SEQ ID NO：2所示的第二核苷酸片段，所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，所述第一探针用于与甲型流感病毒的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第一荧光信号，所述第二探针用于与乙型流感病毒的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第二荧光信号，其中，所述第一荧光信号与所述第二荧光信号不同。

2.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增甲型流感病毒的第一引物组和用于扩增乙型流感病毒的第二引物组，其中：

所述第一引物组包括第一内引物对、第一外引物对和第一环引物对，其中，所述第一内引物对包括SEQ ID NO：3所示的内引物FIP-Ⅰ和SEQ ID NO：4所示的内引物BIP-Ⅰ，所述第一外引物对包括SEQ ID NO：5所示的外引物F3-Ⅰ和SEQ ID NO：6所示的外引物B3-Ⅰ，所述第一环引物对包括SEQ ID NO：7所示的环引物LF-Ⅰ和SEQ ID NO：8所示的环引物LB-Ⅰ；

所述第二引物组包括第二内引物对、第二外引物对和第二环引物对，其中，所述第二内引物对包括SEQ ID NO：9所示的内引物FIP-Ⅱ和SEQ ID NO：10所示的内引物BIP-Ⅱ，所述第二外引物对包括SEQ ID NO：11所示的外引物F3-Ⅱ和SEQ ID NO：12所示的外引物B3-Ⅱ，所述第二环引物对包括SEQ ID NO：13所示的环引物LF-Ⅱ和SEQ ID NO：14所示的环引物LB-Ⅱ。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述第一内引物对、所述第一外引物对、所述第一环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)；所述第二内引物对、所述第二外引物对、所述第二环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。

4.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的探针和/或如权利要求2-3任意一项所述的引物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲剂、逆转录酶、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和镁盐。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的各成分预先混合形成冻干制剂。

7.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测甲流和乙流病毒的方法，其特征在于，包括：

提取待测样本的基因，配置扩增反应体系，以待测样本的基因为模板，进行环介导恒温扩增；其中，所述扩增反应体系包括如权利要求1所述的探针和/或如权利要求2-3任一项所述的引物；

对所得扩增产物进行实时荧光检测。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增反应体系还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和镁盐。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增反应体系中，所述第一探针和第二探针的浓度均在0.01～100μM的范围；所述链置换DNA聚合酶的浓度为0.01～10U/μL；所述逆转录酶的浓度为0.01～10U/μL；

所述内引物FIP-Ⅰ、BIP-Ⅰ、FIP-Ⅱ、BIP-Ⅱ的浓度分别在0.008～800μM的范围；所述外引物F3-Ⅰ、B3-Ⅰ、F3-Ⅱ和B3-Ⅱ的浓度分别在0.001～100μM的范围；所述环引物LF-Ⅰ、LB-Ⅰ、LF-Ⅱ和LB-Ⅱ的浓度在0.004～400μM的范围。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进行所述环介导恒温扩增时的恒温温度为60～72℃，恒温扩增的时间为30～70min。