[发明专利]一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法

权利要求书

1.一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以HIV病毒携带者同种亚型的病毒株为模板，使用TOPO-TA克隆制备该亚型的全基因序列感染性克隆及质粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

在HIV病毒携带者同种亚型的病毒株在env区选择中间酶切位点，分析37条基因24个亚型中有20条基因16亚型在6500-7650处可以使用有限制内切酶Afl III(acatgt)酶切位点；把HIV病毒分为前后两段，分别设计引物，以该病毒为模板，使用长片段PCR扩增前后半段，TOPO-TA克隆后，酶切后再互相连接成为TOPO全基因序列感染性克隆及质粒。

3.根据权利要求1或2所述制备方法制得的全基因序列感染性克隆及质粒。

4.一种内含子感染性重组缺陷病毒质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：删除该亚型的全基因序列感染性质粒中env区大部分碱基，插入带有miRNA的内含子生成感染性重组缺陷病毒质粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

miRNA的内含子是使用第1阅读框的tat蛋白的内含子起始区、分枝点和结束区作为第3阅读框的内含子插入env基因删除大部分碱基的区域；

在内含子起始区和分枝点之间插入2个限制内切酶Afl III(ACATGT)和Asc I(GGCGCGCC)位点。

6.根据权利要求4或5所述制备方法制得的内含子感染性重组缺陷病毒质粒。

7.一种感染性重组缺陷病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

使用二质粒包装系统模式，用细胞核转染系统把有效治疗HIV亚型重组缺陷病毒质粒导入带有表达env蛋白质粒的293T细胞，培养该细胞，培养液中含有感染性重组缺陷病毒。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

感染性重组缺陷病毒质粒中内含子含有三组四段+1段miRNA，其中三组四段miRNA是由一段相同的转录为线性RNA的DNA连接的三组相同的四段产生带有loop的发卡状dsRNA的DNA即：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4，它们都是env区最保守碱基片段；三组四段+1段miRNA中的+1段是miRNA-env-5，用于降解感染性重组缺陷病毒env基因转录的前RNA除去内含子后生成的部分gp120和部分gp41融合蛋白的mRNA，使之不产生任何env蛋白片段；

在三组四段+1段miRNA的两端含有限制内切酶Afl III和Asc I，用这两个酶切后得到三组四段+1段miRNA的片段，与用Afl III和Asc I双酶切的权利要求6中内含子的起始区后面，分枝点前面插入2个限制内切酶Afl III和Asc I感染性重组缺陷病毒TOPO开口质粒混合连接成为治疗用感染性重组缺陷病毒质粒。

9.根据权利要求7或8所述制备方法制得感染性重组缺陷病毒。

10.权利要求3的全基因序列感染性克隆及质粒、权利要求6的内含子感染性重组缺陷病毒质粒、权利要求9所述的感染性重组缺陷病毒在制备治疗艾滋病药物中的应用。