[发明专利]提高基因检测灵敏度和速度的方法

说明书

本发明涉及提高核酸检测灵敏度和速度的方法，在利用无外切活性的聚合酶进行核酸合成时，增加外围或者内部结构中引物的数量，无论是针对DNA还是RNA的检测，都可以显著提高基因检测的灵敏度和速度的速度。使用该技术，可以进一步发挥核酸检测的优势，在各种应用场景中，都意义重大。

[技术领域]

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及基因检测的方法。

[背景技术]

多聚集链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitativePCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

上世纪9O年代以来，出现了几种新的核酸扩增方法：核酸等温扩增法(nucleicacid sequence—basedamplification，NAS-BA)、自序列复制法(self—SUS—rainedsequence replication，3SR)和链置换扩增法(strand displacement amplification，SDA)等。Noto—mi等]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(1oop—mediated isothermalamplification。LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(60-65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，具有替代PCR方法的可能性。

无论是PCR检测系统，还是恒温扩增系统，虽然已经是最为灵敏的检测手段了，但是在实际工作中，仍然会碰到灵敏度不够的情况。另外，检测的速度也是大家

[发明内容]

在不具有外切活性的DNA聚合酶进行的核酸扩增反应中，如果在引物的外围或者结构的内部增加引物的数量，因为聚合酶不具有外切活性，每一次扩增的产物都会被保留下来，聚合的过程就是链置换的过程。后面的引物会把前面引物合成的新链剔出双链，形成裸漏的单链，会更容易结合新的引物，继续基因扩增。另外，因为引物位置不同，相互之间不影响和匹配区域的结合，会显著增加退火形成双链的机会。因此，核酸扩增的产物将会大大的增加，最终核酸合成的速度和灵敏度将会得到极大的提高。

LAMP方法是依靠具有链置换功能的聚合酶Bst大片段参与的环介导的基因合成，只需要一个反应温度，利用引物之间形成的发卡结构进行连续扩增。利用本发明，在引物的外围和环结构的内部增加引物的数量，可以将LAMP方法合成核酸的速度变的更快。通过实验对比，在增加引物的情况下，核酸合成的速度和灵敏度都得到了显著的提高。

另外，本发明同样适用于反转录定量PCR的反转录过程。在PCR引物的外围增加引物，同时选择无Rnase H活性的逆转录酶，或者使用带有逆转录功能的链置换聚合酶，可以在逆转录的过程中对模板进行倍增，提高后续PCR检测的灵敏度和速度。

附图说明

图1为本发明的第一实验效果图；

图2为本发明的第二实验效果图；

图3为本发明的第三实验效果图；

图4为本发明的第四实验效果图；

图5为本发明的第五实验效果图；

图6为本发明的第六实验效果图；

图7为本发明的第七实验效果图。

[具体实施方式一]

以下通过以下实施例来阐述本发明所述提高核酸合成的灵敏度和速度的方法。

材料与方法