[发明专利]一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用固定化微球生产γ‑氨基丁酸的方法，具体涉及从L.plantarum Yll.03染色体基因组中克隆得到目的基因gadB，构建重组载体，并将该重组载体电击转入如乳酸乳球菌细胞中，用于重组GAD的表达及获取；以结冷胶为材料，利用固定化酶技术实现GAD的包埋；最终，将固定化微球投入米醋和味精混合液中，用于催化生成GABA。

技术领域

本发明属于微生物发酵与固定化酶领域，涉及一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种在动物、植物及微生物体内广泛存在的非蛋白质氨基酸，又称氨酪酸、哌啶酸。GABA是哺乳动物体内主要的抑制性神经递质，具有延缓大脑衰老、降血压、治疗神经疾病、抗心律失常等多种生理功能；且在改善糖尿病人的生理状况、改善脂质代谢、防止动脉硬化、改善肝肾机能和抑制癌细胞生长等方面展现出较高的功能价值；因而，在食品、医药及化工等领域具有广阔的应用前景。

目前，GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两大类。化学合成法反应速度快、产量高，但其普遍存在能耗高、反应条件苛刻、副产物多以及环境污染大等问题；且所制备的GABA不能用于食品工业和饲料领域，应用范围较窄。生物合成法由细胞中谷氨酸脱羧酶(GAD)所介导，其催化L-谷氨酸脱羧生成GABA。研究显示，GAD广泛存在于细菌、酵母和丝状真菌等各种微生物中。利用GAD或含有GAD的微生物转化制备GABA，不受资源、环境和空间等限制，已成为近年来生产GABA的研究热点。

目前已有多种微生物，包含食品级微生物(如乳酸菌)发酵制备GABA的相关研究；此外，采用壳聚糖、海藻酸钙及羧基磁珠等材料实现GAD固定化亦有诸多报道。然而，上述报道中的GAD来源及反应体系罕有完全达到食品级制备体系。本发明突破上述屏障，提供一种利用固定化GAD酶催化生产食品级GABA的新方法，该方法大幅提升了固定化酶的稳定性，实现了不同含量食品级GABA的制备。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种生产食品级γ-氨基丁酸的方法，该方法产生的γ-氨基丁酸可以直接服用。

本发明的目的之二在于提供一种谷氨酸脱羧酶的固定化微球及其制备方法，所述固定化微球具有较高的稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种生产γ-氨基丁酸的方法，包括步骤：

1)构建含谷氨酸脱羧酶基因的重组菌株，诱导表达谷氨酸脱羧酶；

2)分离纯化表达的谷氨酸脱羧酶；

3)制备谷氨酸脱羧酶的固定化微球；

4)使用固定化微球催化谷氨酸钠产生γ-氨基丁酸。

进一步，步骤1)中重组菌株的构建包括：

1)将植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因连接至载体上，构建重组质粒；

2)将重组质粒转染到乳酸乳球菌中，构建重组菌株。

进一步，1)中所述的载体为pNZ8148，谷氨酸脱羧酶基因

进一步，2)中所述的乳酸乳球菌为Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的具体实施方式中，谷氨酸脱羧酶基因序列的Genebank登录号为：MN661347,核苷酸序列见SEQIDNO.3，菌株L.plantarum Yll.03的16SrDNA部分序列的GeneBank登录号为：MN636335，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

进一步，构建重组质粒时，扩增谷氨酸脱羧酶基因的引物序列如SEQIDNO.1～2所示。