[发明专利]一种利用固定化微球生产γ-氨基丁酸的方法

权利要求书

1.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤：

1)构建含谷氨酸脱羧酶基因的重组菌株，诱导表达谷氨酸脱羧酶；

2)分离纯化表达的谷氨酸脱羧酶；

3)制备谷氨酸脱羧酶的固定化微球；

4)使用固定化微球催化谷氨酸钠产生γ-氨基丁酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中重组菌株的构建包括：

1)将植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因连接至载体上，构建重组质粒；

2)将重组质粒转染到乳酸乳球菌中，构建重组菌株；

优选的，1)中所述的载体为pNZ8148；优选的，2)中所述的乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000；更为优选的，构建重组质粒的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中采用nisin进行诱导表达，优选的，nisin的终浓度为10ng/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中分离纯化步骤包括：

1)离心收获菌体细胞；

2)超声破碎菌体细胞；

3)收获细胞破碎上清液；

4)采用Ni-NTA亲和层析分离纯化谷氨酸脱羧酶；

优选的，超声条件为：功率400W，工作3s，间歇6s，超声30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中制备谷氨酸脱羧酶固定化微球方法包括：

1)将结冷胶加入去离子水中，搅拌均匀；

2)加入纯化的谷氨酸脱羧酶，并混合均匀；

3)将混合液逐滴加入CaCl₂溶液中；

4)磁力搅拌使其硬化，形成固定化微球。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，2)中谷氨酸脱羧酶的终浓度为14-15μg/mL，优选的，4)中磁力搅拌的条件为25℃、150rpm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中的催化pH为4.0-5.5，优选的pH为pH4.0-4.7，优选的，调节pH的试剂为醋酸，更为优选的，所述醋酸为食用醋。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中催化温度为25-50℃，优选的，催化温度为25-42℃。

9.一种谷氨酸脱羧酶的固定化微球，其特征于，该固定化微球的制备方法如下：

1)将结冷胶加入去离子水中，搅拌均匀；

2)加入纯化的谷氨酸脱羧酶，并混合均匀；

3)将混合液逐滴加入CaCl₂溶液中；

4)磁力搅拌使其硬化，形成固定化微球；

优选的，2)中谷氨酸脱羧酶的终浓度为14-15μg/mL；优选的，4)中磁力搅拌的条件为25℃、150rpm。

10.权利要求9所述的固定化微球在制备γ-氨基丁酸中的应用。