[发明专利]一种高效提高微藻甘油三酯含量的代谢工程方法

说明书

本发明公开了一种高效提高微藻甘油三酯含量的代谢工程方法。本发明发现了一种微藻来源、高活力的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，该DGAT在微藻细胞中的高效表达能够提供一种代谢拉力，增强流向甘油三酯(TAG)合成的碳流，从而提高TAG含量。通过代谢工程方法获得的高产油微藻细胞可作为油脂提取纯化的原料，用于生物能源和食品等。

技术领域

本发明属于生物代谢工程领域，具体涉及一种通过代谢工程提高微藻中性油脂甘油三酯含量的方法。

背景技术

能源是经济可持续发展的动力，当今社会经济发展所需的能源主要依靠传统化石能源，但是化石能源不但不可再生，其燃烧会释放大量温室气体和大气污染物。生物柴油被认为是最有潜力代替传统化石燃料解决交通运输燃油问题的可再生生物能源。生物柴油的使用不会导致大气中二氧化碳的净积累，而且有害气体排放量比传统柴油低。以微藻为原料制备生物柴油有以下优势：1)微藻培养周期短，生长速率快；2)微藻可在海洋、湖泊甚至潮湿的土壤中进行培养，不占用耕地；3)微藻油脂含量高，单位面积的产油量远远高于其他油料作物；4)微藻可生产蛋白质、碳水化合物、高值产物等，在人类食品和动物饲料的应用中有前景；5)可利用工业生活废水和废气进行微藻培养，既经济节约，又清洁环保；6)培养方式多样，既能自养、异养，又能混养，既能分批培养，又能半连续和连续培养，通过对培养条件的控制，全年均可持续获得生物质原料。

为了提高微藻油脂含量从而进一步降低生产成本，代谢工程改造甘油三酯(TAG)合成途径是行之有效的策略之一。在微藻TAG生物合成中，依赖于酰基CoA 的从头合成途径被认为占主导地位。它起始于3-磷酸甘油，经过三个酰基化反应形成。最后一个酰基化反应是此途径的限速步骤，由甘油二酯酰基转移酶(DGAT)催化，将酰基从酰基CoA上转移到甘油二酯(DAG)生成TAG，储存在脂滴中。过表达限速酶基因DGAT有潜力提高TAG的含量。

发明内容

本发明的目的是提供具有高活力、催化TAG合成的DGAT，及其基因和表达载体，通过代谢工程的方法，提高TAG在微藻中的生物合成，从而降低微藻油脂的生产成本。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，来源于三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，是下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)相同的功能。

序列表中SEQ ID No：1所示氨基酸序列由756个氨基酸残基组成，含有8个疏水跨膜区域。通过NCBI蛋白序列比对软件分析表明，该蛋白序列含有MBOT superfamily保守区域，属于DGAT。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法，以及对蛋白功能的检测均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白并检测其功能。

编码上述甘油二酯酰基转移酶(DGAT)的基因也在本发明的保护范围内。所述基因的核酸序列可以是三角褐指藻DGAT基因的cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如，序列表中SEQ ID NO：2所示的是三角褐指藻DGAT1基因的编码序列。

包含上述核酸序列的载体、宿主细胞也在本发明的保护范围内。