[发明专利]基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法

说明书

本发明属于淡水养殖的技术领域，涉及基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法。本发明包括以下步骤：(1)提取感染嗜水气单胞菌的日本沼虾的血淋巴，分离血细胞，裂解细胞提取蛋白质；(2)对步骤(2)获得的蛋白质进行胰蛋白酶酶解，对酶解肽段进行iTRAQ标记；(3)对步骤(3)标记的肽段进行纯化、液相色谱分离和质谱分析；(4)对步骤(3)获得的质谱分析结果进行蛋白质鉴定和定量分析及生物信息学分析，分析获得差异表达蛋白质。本发明基于iTRAQ对受感染日本沼虾的快速蛋白质组学研究，为进一步研究免疫相关蛋白的作用提供参考。

技术领域

本发明属于淡水养殖的技术领域，涉及基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法。

背景技术

目前，国内外学者对嗜水气单胞菌的生物学特性、流行病学特征、快速鉴定、分型及其蛋白质组学等研究已有了很大进展。针对虾类免疫机制的研究主要集中在海水养殖虾中，对中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾等海水虾的免疫基因及免疫相关蛋白的研究取得了较丰富的成果。海水虾类的研究结果固然能为淡水虾类的免疫机制研究提供参考，然而淡水养殖虾类同海水养殖虾类毕竟暴露于不同的生长环境，面对的外界刺激不同，具有淡水养殖环境的特异性。现阶段的研究结果极大的丰富了日本沼虾抗感染免疫的基因数据，然而，随着对基因组研究的深入，人们认识到单纯从基因组信息并不能完全揭示生命的奥秘。因为只有蛋白质才是生命活动的功能载体，有功能的蛋白质是基因在转录、翻译甚至是翻译后经过剪接加工产生的，而蛋白质翻译后功能修饰并不是由基因决定。目前对嗜水气单胞菌感染后沼虾血细胞的蛋白质组研究还未见报道。

蛋白非标记定量技术(Label free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标记，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。缺点：对质谱的重复性要求比较高；分析复杂样品的能力不如标记定量方法。

SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)标记是一种代谢型的标记技术。利用天然同位素(轻型)和稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的必需氨基酸完全掺入到细胞新和成的蛋白质中替代原有的氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白质按细胞数或蛋白量等比例混合、纯化后进行质谱鉴定。最后通过比较一级质谱图中轻、重同位素标记的肽段峰面积，从而对于不同细胞样品的同一蛋白质进行相对定量。但是也存在以下不足：对于生物医学研究中常用的组织样品，体液样品等无法分析；对于动物模型的标记成本太大，无法实现。

双向电泳技术(2-DE)：蛋白质首先根据其等电点在pH梯度胶内等电聚焦，然后按照它们的相对分子量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离，从而获得二维的蛋白质分离图谱。缺点：适用于丰度较高的蛋白，并且对于疏水性、极碱或极酸性蛋白不适合；对样本的需求量较大，原则上每个样品不低于1mg。

同位素标记相对和绝对定量技术，iTRAQ(isobaric tags for relative andabsolutequantitation)，是一种体外同位素标记技术，是蛋白质组学定量研究技术。该技术利用4种或8种同位素试剂标记多肽末端氨基或赖氨酸侧链氨基基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

发明内容

本发明的目的在于对嗜水气单胞菌感染后沼虾血细胞的蛋白质组进行分析，提出了基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，应用iTRAQ技术检测嗜水气单胞菌感染日本沼虾0h、12h、24h、36h后血细胞中的差异表达蛋白，并进行GO功能分类和KEGG信号通路分析。

本发明是采用以下的技术方案实现的：