[发明专利]基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法

权利要求书

1.一种基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取感染嗜水气单胞菌的日本沼虾的血淋巴，分离血细胞，裂解细胞提取蛋白质；

（2）对步骤（1）获得的蛋白质进行胰蛋白酶酶解，对酶解肽段进行iTRAQ标记；

（3）对步骤（2）标记的肽段进行纯化、液相色谱分离和质谱分析；

所述步骤（3）液相色谱分离具体包括以下步骤：

（3.1）色谱柱以 A 液平衡，将步骤（2）中已iTRAQ标记的肽段由进样器上样到色谱柱进行分离，流速为 1 ml/min；液相梯度如下：0-25min，B液线性梯度从0%-10%；25min-32min，B液线性梯度从10%-20%；32min-42min，B液线性梯度从20%-45%；42min-47min，B液线性梯度从45%-100%；47min-52min，B液维持在100%；60min以后，B液重置为0%；其中，缓冲液A液为10mM KH₂PO₄, 25% (v/v)乙腈, pH 3.0，B 液为 10 mM KH₂PO₄, 500 mM KCl, 25% (v/v)乙腈 pH 3.0；

（3.2）洗脱过程中监测214 nm的吸光度值，每隔1min收集洗脱组分，分别冻干后采用C18 Cartridge脱盐；

（3.3）色谱柱以95%的A液、5%的B液平衡，将脱盐后的肽段上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300 nl/min；其中，缓冲液A液为0.1%(v/v)甲酸水溶液，B液为0.1%(v/v)甲酸+84%(v/v)乙腈的水溶液；

（4）对步骤（3）获得的质谱分析结果进行蛋白质鉴定和定量分析及生物信息学分析，分析获得差异表达蛋白质；生物信息学分析依次包括以下步骤：差异表达蛋白质聚类分析、差异表达蛋白质Gene Ontology功能富集分析、差异表达蛋白质KEGG通路富集分析、蛋白质相互作用网路分析和平行反应监测PRM技术验证。

2.根据权利要求1所述的基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括从感染后的日本沼虾围心腔中抽取血淋巴，与抗凝剂混合，将混合物4℃离心，去上清，再加入质量浓度0.85%NaCl溶液洗涤血细胞。

3.根据权利要求1所述的基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤（4）中对出现差异表达的蛋白中筛选免疫相关蛋白进行平行反应监测PRM技术验证。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，其特征在于，该方法用于制备嗜水气单胞菌感染日本沼虾的生物标志物或诊断试剂盒。