[发明专利]一种减毒单核细胞增多性李斯特菌的构建方法和用途

说明书

本发明涉及基因工程领域，旨在提供一种减毒单核细胞增多性李斯特菌的构建方法和用途。是以单増李斯特菌野生株EGD‑e菌株为构建亲本，将hly基因的第478位天冬酰胺和第479位缬氨酸分别突变为丙氨酸，且不含质粒；最终所得减毒株命名为Lemo‑C07，其保藏编号为：CGMCC 18647，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的单増李斯特菌的减毒株可用于活疫苗治疗载体或免疫佐剂；通过氨基酸定点突变单增李斯特菌毒力基因hly的关键位点N478和V479后使该细菌毒力大大降低(达到安全级别)，但仍保留了非常好的免疫原性。由于是在李斯特菌基因组上进行直接突变，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不会由于质粒的丢失而影响李斯特菌的生长。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单核细胞增多性李斯特菌，具体来说是一种减毒的单核细胞增多性李斯特菌，可用于递送表达外源抗原，用作活疫苗载体。

背景技术

单増李斯特菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌，李斯特菌能够在溶血素O(LLO)和磷脂酶C(PLC)协助下使其从宿主细胞吞噬体逃逸到宿主细胞的细胞质中，并通过毒力因子ActA招募宿主肌动蛋白聚集，推动其在宿主细胞间迁移和运动。由于李斯特菌具有独特的细胞内寄生生活，因而可以作为一种活载体疫苗，通过刺激机体分泌多种重要的细胞因子，如IFN-γ，IL-4，IL-12和IL-18来诱导先天免疫的产生，还能通过优先促进抗原特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞增殖来产生适应性细胞免疫。在被抗原呈递细胞的吞噬后，细菌能够通过穿孔吞噬溶酶体而逃逸到细胞的细胞质中。一旦进入细胞质，细菌抗原就会被加工、呈递于MHC分子表面，进而被特异性细胞毒性T淋巴细胞识别，从而引发对细菌抗原的细胞免疫反应。通过重组李斯特菌疫苗不仅可以分泌细菌抗原而且还能分泌肿瘤抗原，已经产生足以引起动物已建立肿瘤消退的免疫反应。

然而，单増李斯特菌可以穿过肠屏障，通过血流传播并到达肝脏、脾脏从而引起肠胃炎，通过血脑屏障和胎盘屏障引起脑膜炎、败血症和胎儿流产。孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下的成年人有较高的感染风险。因此，菌株的减毒是有必要的。

治疗癌症的传统方法是手术切除，放疗，化疗和治疗性疫苗，手术切除、放疗、化疗易出现转移和复发等弊端，相比之下疫苗疗法的优点是对机体的伤害小，且毒性低，但国内使用的疫苗主要是传统的灭活疫苗及亚单位疫苗存在免疫周期长，免疫效果差等缺点。减毒活载体疫苗的特点是能引起较强的免疫反应，由于单増李斯特菌能在巨噬细胞内增殖，其能够更好的递呈抗原，除此之外，已知单増李斯特菌LLO能够增强抗原的特异性免疫反应。因此，减毒活载体疫苗能有效的解决传统疫苗面临的技术缺陷，能更好的提高免疫治疗效果，缩短免疫周期，提搞患者的存活率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种减毒单核细胞增多性李斯特菌的构建方法和用途。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种减毒单核细胞增多性李斯特菌，是以单増李斯特菌野生株EGD-e菌株为构建亲本，将hly基因(Locus tag：lmo0202；Gene ID:987033；编码蛋白：溶血素LLO)的第478位天冬酰胺和第479位缬氨酸分别突变为丙氨酸，且不含质粒；最终所得减毒株命名为Lemo-C07(分类命名为单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes)，其保藏编号为：CGMCC 18647，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了一种抗体，是由前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌免疫产生。

本发明还提供了一种疫苗，含有前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌。

本发明还提供了所述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。

本发明还提供了所述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，包括以下步骤：