[发明专利]一种减毒单核细胞增多性李斯特菌的构建方法和用途

权利要求书

1.一种减毒单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，是以单増李斯特菌野生株EGD-e菌株为构建亲本，将hly基因的第478位天冬酰胺和第479位缬氨酸分别突变为丙氨酸，且不含质粒；最终所得减毒株命名为Lemo-C07，其保藏编号为：CGMCC 18647，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌免疫产生。

3.一种疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌。

4.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。

5.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒；

(2)制备EGD-e感受态细胞；

(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)EGD-e与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

构建关于单核细胞增多性李斯特菌EGD-e的hly基因第257到529氨基酸的重组同源臂，以Sal I和BamH I为酶切位点，经酶切、酶连至pKSV7，设计点突引物，进行关键位点的突变，构建用于同源重组的重组质粒。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

将野生型单核细胞增多性李斯特菌EGD-e接种于经过滤除菌的100ml BHI+0.5M蔗糖的培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀ nm值为0.2；加入青霉素G使其终浓度为50mg/mL并过滤除菌，37℃震荡培养2h；收集菌体，用1mM HEPES+0.5M蔗糖混合液洗两遍；向沉淀中加入1mL1mM HEPES+0.5M蔗糖混合液，重悬菌体；分装，置于-80℃冰箱备用。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：

将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得减毒单増李斯特菌感受态细胞中，加入1mL 2×BHI和1M蔗糖等体积混合的混合液中，充分混匀，置于30℃恒温培养箱3h；将转化液涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置于37℃培养。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：

取步骤(3)中获得菌落，在液体培养基扩大培养，进行验证；42℃进行同源交换，30℃连续传代丢质粒，进行PCR筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌Lemo-C07；将测序正确的将菌液和60％甘油1:1混合，放入-80℃冰箱保存。