[发明专利]一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统

权利要求书

1.一种HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：

第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；

第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；

第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；

第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。

2.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：

步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；

步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；

步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；

步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。

3.如权利要求2所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。

4.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：

步骤一，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保持冰量没过抗体液面，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s；

步骤二，搅拌下加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，搅拌30min；

步骤三，使用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时；

步骤四，解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。

5.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第三步中慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存具体包括以下步骤：慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01MpH7.4的PBS缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。