[发明专利]一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺

说明书

本发明提供一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，所述的制备高效扩增工艺包括了采集脐血、添加试剂盒因子、离心、打匀、培养、转袋、增殖、收集冻存等工序。本发明在扩增NK细胞之前对脐血进行多项指标进行检测，确保脐血符合要求，在NK细胞扩增后进行二次检测，增强NK细胞的产品质量，整个高效扩增工艺操作简便，劳动强度小，制备成本低、扩增工艺易于掌握、制备效率高、制备数量大的优点。

技术领域

本发明涉及NK细胞扩增技术领域，具体是一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺。

背景技术

NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell ,NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (Trail)分子使靶细胞凋亡。目前NK细胞的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高，这些都限制了NK细胞在临床中上大规模运用，因此，随时可以进行配型的脐血成为了制备NK细胞的最新来源，现有的脐血制备NK细胞的制备过程中存在着工艺复杂、操作不便、制备效率低、制备数量小的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有脐血制备NK细胞的制备过程中存在着工艺复杂、操作不便、制备效率低、制备数量小的问题，提供一种制备成本低、制备工艺易于掌握、操作方便、制备效率高、制备数量大的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：

一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；

二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；

三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息（如姓名、性别、年龄、等信息）和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；

四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；

五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；

六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；

七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；

八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；