[发明专利]一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺

权利要求书

1.一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：

一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；

二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；

三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；

四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；

五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；

六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；

七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；

八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；

九、步骤八中上部分离出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培养基混匀成细胞悬液40ml，细胞悬液中加入相应试剂盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液体，吸的过程中不要碰包被面，加入10ml血浆，加入40ml细胞悬液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养；

十、NK培养液配制方法：增殖培养基为每瓶1000ml NK-EX培养基加入相应试剂盒因子；活化培养基为每500ml增殖培养基中加入本试剂盒一支相应试剂盒因子；先使用活化培养基，再使用增殖培养基；

十一、第4天：加入40ml活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；

十二、第6天：加入70ml NK活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；

十三、第8天转袋：NK细胞在T175培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量便要将细胞转入到一个培养袋中继续进行培养；

（1）从培养箱中拿出培养NK细胞的T175瓶标记为，显微镜下观察细胞状态和数量，观察过之后将其放在超净工作台内操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并将其中的培养液倒入备好的T175培养瓶中标记为，将剩余血浆全部倒入该培养瓶内，用移液管吸10ml 活化培养基于培养瓶内，并不断吹洗瓶的内壁10-20次，如此反复3次，直到把瓶内壁上的大部分细胞吹掉，并把培养液加入到培养瓶中；

（2）准备一个50ml注射器，检查是否漏气，去除针头和推进器，用镊子夹着注射器放在补液架上；

（3）拿一个血培养袋平铺在超净台内，用酒精棉球擦拭培养袋的进样口管，用镊子打开盖子，将进样管连在50ml注射器上，打开止液夹，加入约100ml活化培养基检测袋子是否漏液；

（4）检测完毕，加入瓶中的细胞悬液，在该培养瓶内加入新鲜培养液洗一下瓶子，洗液倒入培养袋内，清洗两次；

（5）细胞悬液倒入细胞袋内之后开始加入新鲜的培养基，加入剩下的所有活化培养基；

（6）加入培养基完成之后，排干净进样管内的液体，关闭止液夹，盖上进样管的盖子，用酒精棉球擦拭盖子周围和封口膜，并用封口膜封该培养袋进液管口，放到37度5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养；

十四、第10天：观察细胞生长状态以及细胞的数量，数量达到一定程度，且培养基明显变黄，需要补液500ml，此时加入的是增殖培养基；

（1）将培养袋平铺于超净工作台上，50ml注射器检漏并留管体，置于补液架上；

（2）用镊子撕掉培养袋进液口封口膜，用酒精棉球消毒并打开进液口盖子；

（3）将进液口与注射器进口连接；

（4）将活化培养基倒入注射器管中，打开进液管上的止液夹，倒入500ml培养液；

（5）拔掉进液管，排净管内液体，关闭止液夹，用镊子盖上盖子，酒精棉擦拭消毒，封口膜封口；

十五、第13天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK增殖1000ml，混匀，取出30ml培养液，送检第三方做检测同时做好自检；

十六、第16天：收集NK细胞悬液，计数冻存。