[发明专利]快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒，所述LAMP引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。其中，正向外引物F3如SEQ ID No.1所示，反向外引物B3如SEQ ID No.2所示，正向内引物FIP如SEQ ID No.3所示，反向内引物BIP如SEQ ID No.4所示，正向环引物LF如SEQ ID No.5所示，反向环引物LB如SEQ ID No.6所示。通过采用上述3对特异的LAMP引物对待测样品进行LAMP扩增可实现对苹果腐烂病菌的快速检测，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强、检测速度快，且无需贵重仪器设备，适用于田间苹果腐烂病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定。

技术领域

本发明涉及苹果腐烂病菌检测方法技术领域，尤其涉及快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒。

背景技术

苹果(Malus domestica)果实酸甜可口，营养丰富，是所有蔬果中营养价值最接近完美的一个，被誉为“百果之王”。近年来随着我国苹果产业的迅速发展，中国已经成为世界最大的苹果生产基地，苹果的种植面积及产量均占世界50％以上。

由黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的苹果腐烂病是我国主要苹果产区危害最为严重的枝干性病害，被称为苹果树的“癌症”。腐烂病能够侵染苹果树韧皮部、木质部，导致树势衰弱、枝干枯死、死树，甚至毁园。苹果腐烂病菌具有潜伏侵染的特点，病菌侵入树体后，通常不立即致病，而处于潜伏状态。当树体或局部组织衰弱时，腐烂病菌就会由潜伏状态转变为致病状态而引起症状。然而，当前针对苹果腐烂病尚无较好的抗病品种且腐烂病菌的潜伏期较长，早期难以通过肉眼观察症状被发现，因此，快速、准确地在发病前期或初期对病菌的侵染动态进行监测，及时采取有效的防治措施对控制病害在田间的发生具有重要意义。

环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是日本荣研化学的Notomi博士等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30～90分钟即可完成扩增反应，效率可达10⁹～10¹⁰个数量级。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此肉眼观察即可判定扩增结果，也可添加染料至扩增产物中通过颜色变化进行判断，无需专业的仪器设备，运用普通水浴锅或其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特点。凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在多种植物常见病害的快速检测中得到了应用，极大地提高了植物病害鉴定的效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施提供了科学依据。然而，目前该技术在苹果腐烂病菌的检测中的应用尚无相关报道。

目前，苹果腐烂病菌的检测主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学特征鉴定和致病性测定结果，该方法对专业技术要求比较高，且存在一定的不确定性，且程度繁琐、周期长。而目前的普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求。因此，上述现有苹果腐烂病菌的检测方法极大地影响了田间中苹果腐烂病病情的及时发现和实时监测，还有待进一步发展。

发明内容

针对现有技术中对苹果腐烂病菌的检测方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低的缺点，本发明实施例提供了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒，该方法检测速度快、操作简单、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物，该引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。