[发明专利]快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒

权利要求书

1.快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物，其特征在于，由一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成，其中，正向外引物F3如SEQ ID No.1所示，反向外引物B3如SEQ ID No.2所示，正向内引物FIP如SEQ ID No.3所示，反向内引物BIP如SEQ IDNo.4所示，正向环引物LF如SEQ ID No.5所示，反向环引物LB如SEQ ID No.6所示。

2.一种快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的LAMP引物进行LAMP扩增。

3.根据权利要求2所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用待测样品DNA模板，LAMP引物建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

26μL的LAMP反应体系包括以下成分

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO₄：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine：4μL

2.4mM的HNB：2μL

8,000U/mL的BstDNHA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL；

(2)可直接通过肉眼观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或通过琼脂糖电泳观察梯形条带来判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

4.根据权利要求3所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，作为模板的待测样品DNA为提取的待测苹果腐烂病菌的基因组，或者用待测苹果腐烂病菌的ITS基因扩增产物。

5.根据权利要求4所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，待测样品的基因组DNA的提取方法为：

取待测样品放入含有400μL DNA裂解液的离心管内，加入一颗钢珠，在组织研磨仪中65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，于-20℃条件下静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物；

其中，DNA裂解液包括以下成分：0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na2，0.2M NaCl和3mMSDS，PH＝8.0。

6.根据权利要求2所述的检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，65min；接着，80℃，10min。

7.一种苹果腐烂病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物。