[发明专利]一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途

说明书

本发明公开了一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。所述突变体是将来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽的C端第‑1位和/或第‑3位氨基酸突变为丙氨酸,即将C端的最后三位氨基酸序列突变为AXA或者在信号肽C端后增加氨基酸序列AXA，所述X为任意氨基酸。本发明构建方法简单易行，适用于枯草芽孢杆菌系统，信号肽突变后的碱性蛋白酶表达量均高于未突变体。本发明为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，有效推动了碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途。

背景技术：

碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。并且芽孢杆菌具有以下优点：(1)在工业生产中，一般要求菌株对健康或环境无毒无害，芽孢杆菌中除了炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌的少数菌株外，几乎都没有致病性；(2)芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

信号肽对于蛋白的分泌表达起着关键的作用。在枯草芽胞杆菌中，蛋白质分泌到细胞膜外主要通过两种途径，Sec途径和Tat途径，其中，绝大部分蛋白质是通过Sec途径分泌的，只有少量需要先折叠的蛋白质通过Tat途径分泌。Sec途径的信号肽虽然没有可识别的通用序列，但它们基本都由三个部分组成：由6个氨基酸组成的带正电的N端，10-18个氨基酸组成的疏水中间部分及H端，以及信号肽肽酶识别区域的C端。C端是信号肽肽酶识别位点对信号肽的切割效率起着重要的作用。