[发明专利]一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。通过构建含有HcCLA1基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒，农杆菌介导法转化红麻，诱导红麻内源HcCLA1发生沉默，有效降低了红麻HcCLA1基因的表达水平，导致白化表型。本发明方法建立了TRV‑VIGS沉默红麻内源基因从而鉴定基因功能的体系，具有快速，高通量，易于操作的优势，为开展红麻基因功能研究提供了新途径。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。

背景技术

病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。其中由烟草脆裂病毒 (tobaccorattle virus, TRV)诱导的基因沉默(TRV- VIGS), 以其持续时间长、沉默效率高, 寄主植物病毒症状轻, 不会掩盖沉默表型, 且在各种组织均可产生基因沉默等优点, 成为目前应用广泛的一类基因沉默体系。TRV-VIGS已在番茄、烟草、 辣椒、拟南芥等植物上成功应用。

在不同的植物中建立VIGS体系，可选用1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（cloroplasto alterados，CLA1）基因作为报告基因。植物CLA1(cloroplastos alterados1)基因参与叶绿体发育过程，进化中高度保守，CLA1基因突变体有明显的白化表型, 是易于识别的标记性状。本发明构建了携带HcCLA1干扰片段的烟草脆裂病毒重组载体，通过农杆菌成功侵染红麻，建立红麻高效VIGS体系,为红麻功能基因组学研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。该方法成功建立红麻HcCLA1基因的VIGS沉默体系，实现简单、高效、低成本鉴定红麻HcCLA1基因功能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1，该基因的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的HcCLA1基因特异性片段，所述HcCLA1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示.

一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体，利用gateway重组克隆技术将HcCLA1基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2--HcCLA1。

一种红麻HcCLA11基因VIGS沉默体系，其构建方法包括以下步骤：

（1）通过冻融法将重组病毒载体pTRV2-HcCLA11转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性；

（2）将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液按体积比1:1混合制成混合菌液；

（3）将红麻种子在步骤（2）的混合菌液中24℃，浸泡24 h；