[发明专利]松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用

说明书

本申请公开了一种松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，含量为0.8x10⁶～1.25x10⁶U/L的胶原酶，以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。同时开提供了一种制备高存活率单细胞悬液的方法，具体配合超声消融仪的消融作用能够使得组织块在极短的时间内分散为单细胞并且尽可能的保留细胞活性，不对细胞本身造成破坏。本申请极大的解决了在用于原代细胞培养和单细胞测序的应用中需要获取高活性原代细胞的技术难题。同时本发明耗时大大缩短，将整个分散过程由现有的酶消化法需要的数小时缩短到数秒内，且稳定性高，单细胞化好，细胞活性高。

技术领域

本发明涉及原代细胞获取的试剂领域，尤其涉及通过动物组织获取原代活细胞的试剂领域，具体涉及松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用。

背景技术

原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

现有的原代细胞的获取方式都是通过制备细胞悬液来获取，然而细胞悬液的制备在现有的常用方式中可分为两种：一种是最为传统的物理制备方式，就是用研磨器进行手工研磨，手工研磨的弊端在于实用范围小，同时制备的单细胞悬液质量因操作者的经验而差别巨大，耗费时间非常长。另一种方式就是通过酶消化法，譬如胰蛋白酶是可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是实际处理过程中，单纯的将组织块置入胰蛋白酶中并不能直接获取到单细胞悬液，且对于胰蛋白酶的浓度、消化处理时间对于组织的裂解影响是非常大的，直接影响着单细胞的数量、完整度、以及存活率。现有的胰蛋白酶对于裂解组织至少需要静放2-4小时，然而，经过这么长的时间，细胞大多或死亡，或失去活性，而没有高存活率的单原代细胞是很难实现原代细胞的成功培养的，因此，含有胰蛋白酶或者同等功效的溶液对于获取高存活率、高单细胞率，确保细胞尽可能不遭受破坏非常重要。

发明内容

为了解决现有技术获取完整的，高存活率的单细胞悬液流程复杂，繁琐，不利于原代细胞培养进行的技术现状和技术问题，本申请提供一种松解保护剂，能够有效的裂解组织块，并在超声波的作用下，迅速的将组织块消融，获得单细胞悬液，且单细胞中存活细胞的比例高达90％以上，能够有效的在原代细胞获得流程上得以极大的简化，提高原代细胞的获得效率并保证原代细胞极高的存活率，解决了以存活原代细胞为实验基础和前提的诸多实验最头疼的一个技术环节。

现有技术中，无论是采用传统的物理研磨的方式，还是通过酶解的方式在整个制备过程中花费的时间都是很长的，一般都会超过2小时，而细胞在这么长的时间内大多都已经失去活性了，甚至已经死亡，后续取得的单细胞悬液无论单细胞率的高低都已经没有了价值。譬如，单细胞测序、原代细胞培养的前提是必须保证制备的单细胞悬液中单细胞率和存活率都要非常高，二者缺一不可。为了解决现有技术中针对获取高存活率的单细胞，本申请提供了一种用于快速获取高存活率、高单细胞率，同时能够将使得制备好的单细胞悬液中的存活单细胞能够长时间的存活，这对于现有单细胞测序和原代细胞培养而言可谓是解决了最困难的一环。

为了达到上述目的，本申请所采用的宋姐保护剂具体为：

一种松解保护剂，由以下组分混合而成：

浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，

含量为0.8x10⁶～1.25x10⁶U/L的胶原酶，

以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。