[发明专利]一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法及其应用

说明书

本发明公开了一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法及其应用，属于生物化学技术领域。在维生素K循环中，γ‑谷氨酸羧化酶(GGCX)利用二氢维生素K(KH₂)为辅因子催化凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化，同时把KH₂转化为维生素K环氧化物(KO)；维生素K环氧化物还原酶(VKOR)催化KO到K，以及K到KH₂，使维生素K可以循环利用。本发明的检测原理是利用产物KH₂在250nm的激发光下可以产生荧光的特性，通过检测产物KH₂的生成量来反映VKOR蛋白的活性；该方法步骤简单，可操作性强，相较传统微粒体法可以快速、实时、高通量地检测VKOR蛋白催化KO或K的活性；采用该方法可有效筛选出靶向VKOR的小分子抑制剂。

技术领域

本发明涉及一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法及其应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

维生素K环氧化物还原酶(VKOR)是临床抗凝血药物华法林(warfarin)的特异性作用靶点。华法林通过抑制VKOR的活性，使KO不能转化为K和KH₂，从而阻断维生素K循环，进而抑制凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基的γ羧基化修饰，达到抗凝血的目的。体外测定VKOR蛋白活性的方法是研究VKOR蛋白性质和抑制剂的重要手段，也可以用于筛选靶向VKOR的新型小分子抑制剂。目前，传统方法是通过提取微粒体进行VKOR蛋白的活性测定，该方法操作繁琐，不便于高通量测定，只能检测催化KO的活性，无法检测催化K的活性，而且活性不能实时检测(Fasco,M.J.,Principe,L.M.,Walsh,W.aFriedman,P.a.Warfarin inhibition ofvitamin K 2,3-epoxide reductase in rat liver microsomes.Biochemistry.22,5655–60(1983)；Rost,S.,Fregin,A.,Ivaskevicius,V.,Conzelmann,E.Hortnagel,K.Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulationfactor deficiency type 2.Nature.427,537–541(2004).)。因此开发一种新的能够实时、高通量测定维生素K环氧化物还原酶体外活性的方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够实时、高通量测定维生素K环氧化物还原酶体外活性的方法。

同时，本发明还提供一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法在筛选靶向VKOR的小分子抑制剂方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，包括以下步骤：

1)材料的准备：

分别配制缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4，储存备用；

缓冲液1的组成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水；

缓冲液2的组成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶剂为水；pH值7.0-7.6；

缓冲液3的组成包括：维生素K环氧化物1-50mmol/L，溶剂为异丙醇；

缓冲液4的组成包括：维生素K1-100mmol/L，溶剂为异丙醇；

2)工作液的配制：

分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液；