[发明专利]一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法及其应用

权利要求书

1.一种维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)材料的准备：

分别配制缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4，储存备用；

缓冲液1的组成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水；

缓冲液2的组成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶剂为水；pH值7.0-7.6；

缓冲液3的组成包括：维生素K环氧化物1-50mmol/L，溶剂为异丙醇；

缓冲液4的组成包括：维生素K1-100mmol/L，溶剂为异丙醇；

2)工作液的配制：

分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液；

分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4，配制GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K浓度为30-80μmol/L的维生素K工作液；

分别取VKOR蛋白和缓冲液1，配制VKOR蛋白浓度为1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；

3)VKOR蛋白催化KO的活性测定：

分别取维生素K环氧化物工作液和VKOR蛋白工作液，混合后加入荧光测量容器中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白催化KO的活性；

VKOR蛋白催化K的活性测定：

分别取维生素K工作液和VKOR蛋白工作液，混合后加入荧光测量容器中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白催化K的活性。

2.根据权利要求1所述的维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，其特征在于：步骤1)中，所述缓冲液2的组成还包括碱性pH值调节剂，碱性pH值调节剂的用量以调节缓冲液2的pH值至7.0-7.6为准。

3.根据权利要求1所述的维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，其特征在于：步骤1)中，所述缓冲液1的组成为：pH值7.5的Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 100mmol/L，LMNG 1g/L或GDN 0.5g/L，溶剂为水；

所述缓冲液2的组成为：GSH 0.5mol/L，碱性pH值调节剂适量，溶剂为水；pH值7.5；

所述缓冲液3的组成为：维生素K环氧化物1mmol/L，溶剂为异丙醇；

所述缓冲液4的组成为：维生素K1mmol/L，溶剂为异丙醇。

4.根据权利要求1所述的维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述VKOR蛋白为人VKOR蛋白。

5.根据权利要求3所述的维生素K环氧化物还原酶体外活性测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液3，混合均匀后室温下平衡1小时以上，得到1mL GSH浓度为80mmol/L、维生素K环氧化物浓度为40μmol/L的维生素K环氧化物工作液；

所述维生素K工作液的配制方法为：取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液4，混合均匀，得到1mL GSH浓度为80mmol/L、维生素K浓度为40μmol/L的维生素K工作液；

所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：取VKOR蛋白，用缓冲液1稀释至人VKOR蛋白浓度为3μmol/L，得到VKOR蛋白工作液。