[发明专利]携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。本发明由幽门螺杆菌抗原或抗原优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒。本发明的携带幽门螺杆菌的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于幽门螺杆菌疫苗开发、相关药物的开发以及利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产幽门螺杆菌蛋白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。

背景技术

A型流感病毒(influenzaAvirus),属于正粘病毒科，其基因组由8个负极性RNA片段(vRNA)组成。在流感病毒中其基因组的8个RNA片段与三种聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)以及核蛋白(NP)结合形成了具有活性的核糖核蛋白聚合体(RNPs)(Eisfeld A J,Neumann G,Kawaoka Y.At the centre:influenza A virus ribonucleoproteins[J].NatureReviews Microbiology,2015,13(1):28-41.)。A型流感病毒感染宿主细胞时，血细胞凝集素(HA)介导病毒颗粒与宿主细胞上唾液酸受体结合。在流感病毒以膜融合的方式进入细胞后，病毒会释放出RNPs，RNPs进入细胞核后开始病毒基因组的复制与转录，8种RNA片段分别转录出信使RNA(mRNA)和互补RNA(cRNA)，mRNA经翻译合成病毒蛋白，cRNA通过复制产生vRNA，之后经过组装产生子代流感病毒(Hutchinson E C,Fodor E.Transport of theinfluenza virus genome from nucleus to nucleus[J].Viruses,2013,5(10):2424-2446.)。

甲型流感病毒的基因组包含8个片段。其中病毒片段聚合酶(PB2)、血细胞凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)的mRNA是单顺反子。很多研究发现聚合酶PB1包含多个翻译起始位点。聚合酶(PA)则可以通过核糖体移框和多个翻译起始位点编码多种蛋白。基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)则会发生RNA的剪接产生多种mRNA(Dubois J,Terrier O,Rosa-Calatrava M.Influenza viruses and mRNA splicing:doing more with less[J].MBio,2014,5(3):e00070-14.)。通过将M和NS中的RNA剪接位点突变并将其开放阅读框通过连接肽连接也可以表达相应的蛋白，拯救出的重组流感病毒在适宜条件下可以正常的复制。

流感病毒反向遗传系统目前主要包括8质粒系统和12质粒系统。目前国际上常用的为8质粒系统，因为12质粒系统所需质粒较多并且对转染效率要求更高。通过将流感病毒基因组8个vRNA的cDNA以克隆的方式正向插入到polⅡ启动子(从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来)和终止序列(牛生长激素poly(A)信号bGH)之间，并在此表达盒之间还反向插入了人polⅠ启动子和鼠polⅠ终止序列从而形成了一个双向表达系统。将这套系统质粒转染真核细胞，就可以实现在同一个模板上由polⅠ控制合成负链vRNA，由polⅡ控制合成正链mRNA并表达蛋白质，之后通过组装产生流感病毒从而完成流感病毒的拯救(Hoffmann E,Neumann G,Kawaoka Y,et al.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids[J].Proceedings of the National AcademyofSciences,2000,97(11):6108-6113.)。因为流感病毒反向遗传系统的开发，使得通过对流感病毒基因组改造拯救出携带有外源片段的重组流感病毒变成了可能。