[发明专利]一种强酸性条件下基质附着生物膜中微生物总DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种强酸性条件下基质附着生物膜中微生物总DNA的提取方法，属于分子生物学技术领域。包括以下步骤：1)采用pH＝4～5的缓冲液1在适宜水压下将微生物从附着基质上洗脱，离心收集菌体样品；2)采用含有EDTA的pH＝7～7.5的缓冲液2进行洗涤、离心收集菌体样品；3)将步骤2)收集的菌体样品进行DNA提取。本发明的方法提取的微生物总核糖核酸质量较好，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总条带明亮清晰，上机测序时DNA链长和浓度符合测序和建库要求，为强酸性条件下微生物生态学和分子生物学研究奠定了技术基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说，涉及一种强酸性溶液条件下基质附着的微生物总DNA的提取方法。

背景技术

近年来，随着测序技术的发展，微生物多样性和功能的分析中，对某一环境中微生物总DNA进行测序的宏基因组技术得到了广泛地应用，宏基因组技术被公认为是目前研究环境微生物群落结构和功能基因最全面、准确的方法，因为它没有特殊的选择性(例如纯培养/富集)，同时也减小了测序技术的偏好性(例如16S rRNA或iTS基因的PCR扩增步骤)。

然而，采用分子生物学技术分析极端酸性条件下的微生物群落存在着技术难点，主要原因在于：环境样品基因组总DNA的提取纯化存在困难，极端酸性环境(pH2)会为微生物带来严重的生存压力，微生物菌体一旦破裂，强酸性环境会导致DNA或RNA在极短的时间内降解为短链的小片段。为了适应复杂生境，微生物自身会产生特殊的聚合酶，组成生物膜、菌团等共同抵抗复杂生境下的生存压力。但环境中存在的各种抑制物(氢离子、腐植酸、酚类化合物和重金属离子等)在低pH值条件下会影响微生物的酶活性，并导致核糖核酸分子的不稳定，直接引发蛋白质的变性和DNA的水解，环境样品中广泛存在的腐植酸类物质与核糖核酸紧密结合也会导致二者被共提取，进一步加大了下游实验的难度。

目前很多研究者采取了不同的方法预处理酸性条件下的微生物，使其满足总DNA提取的需要。这些方法主要可分为两类，一种是在微生物生长的原始位置，通过依次添加不同的试剂，对总DNA进行提取的原位提取法。在《用多种方法提取酸性排水沉积物中微生物DNA》中，黄海采用四种方法来提取样品(pH＝2.47～2.78)的核糖核酸：高盐冻融法、低盐蛋白酶K法、高盐蛋白酶K法和ZR Soil Microbe核糖核酸KitTM法。最后得出结论为使用强的分散剂短时间预洗涤样品一到两次，然后在低盐含量的提取缓冲液中用低盐蛋白酶K法(溶菌酶+蛋白酶K+玻璃珠撞击裂解)的提取步骤裂解细胞，提取的粗核糖核酸用普通凝胶电泳-低熔点凝胶槽法纯化后进行PCR扩增，可以达到较好的效果。

另一种是先应用试剂将微生物群落整体从附着基质上洗涤下来，然后进行提取的异位提取法。在《An effective method of DNA extraction for bioleaching bacteriafrom acid mine drainage》中，Zeng等人总结提取酸性矿井废水(pH＝4.0)微生物基因组核糖核酸的方法为首先用PBS溶液洗涤AMD沉积物样品，然后将收集的菌体置于含有SDS和CTAB的提取缓冲溶液中，先后在沸腾水浴、60±5℃和72℃中孵育，最后用苯酚/氯仿/乙醇和冰乙醇进行核酸抽提与沉淀。

虽然已经有上述已开发的各种针对不同研究者使用的提取方法，但是这些方法均针对环境溶液pH≥2的中强酸性环境，尚未发现一种通用的能够在强酸性溶液环境下(pH2)，提取环境样品总DNA的方法。而且不同于纯溶液环境，附着于固态基质上的环境样品中，重金属和腐植酸等杂质含量较高、成分复杂，造成寻求通用方法更加困难。

目前有关提取酸性条件下微生物基因组核糖核酸的专利也已公开了相关的申请案，如中国专利申请号200910237938.4，公开日期为2011年6月1日，发明创造名称为：高质量提取酸性土壤基因组的方法，其包含取土壤样品10g，与无菌焦磷酸钠溶液混匀并温育30min后，提取基因组核糖核酸，该发明中微生物的温育时间较长，容易导致菌体在长时间脱离自身适宜的酸性环境后死亡裂解。