[发明专利]一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法

说明书

本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，属于生物技术领域。本方法包括以下步骤：1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增；4)绘制出标准曲线；5)计算每克干土中细菌数量。本方法省去添加内标菌株荧光镜检等步骤，大大降低操作难度；且不需要经过连接、转化，再以qPCR扩增，操作简便易学；目标片段特异性好，数据精准度高，重现性好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法。

背景技术

土壤细菌不仅是土壤生态系统中的核心物种，也是最丰富多样的微生物分类，约占微生物总数的90％。土壤细菌调控碳氮等元素循环和有机质矿化过程，对土壤生物化学过程和能量流动具有十分重要的作用。其中氮元素(如固氮作用、硝化作用和反硝化作用)、磷元素(解磷)以及钾元素(解钾)等循环功能只能由土壤细菌完成。由于土壤细菌数量是表征微生物群落大小和功能的一个重要指标，越来越多研究重视环境污染、土地利用和人为扰动对土壤细菌的影响，以及土壤细菌在环境监测、土壤修复、微生物肥料等方面有巨大的应用潜力。同时，由于细菌数量受到土壤类型、土地利用方式、人为干扰、环境污染和土壤理化性质等众多因素影响。因此，提供一种简单迅速、可批量操作和结果精准的细菌数量检测方法具有重要的意义。

目前，我国土壤细菌数量测定方法采用稀释平板法、最大或然法、镜检计数法、荧光显微计数法和高通量测序等方法，但存在着方法粗放烦琐、与国际先进方法脱轨或成本较高等诸多问题。以稀释平板法为例，由于只有很少一部分细菌可以人工培养，因此局限性很大，不能获得细菌数量的可靠信息；荧光计数法虽灵敏度高，但前期处理费时费力，且受抗褪色剂附着量和染料荧光淬灭因素影响，观察计数准确度不高；高通量测序与内标菌株荧光镜检相结合的方法虽精准度高，但成本较高，且对操作技术和实验设备要求较高，并不适合推广。

CN 107653300 A公开了一种测定土壤样品DNA提取率的方法，通过qPCR对比添加到土壤样品中内标基因拷贝数和提取之后样品中内标基因拷贝数计算DNA提取率，具有快速、高效鉴定土壤DNA提取效果的特点，但其方法只能对土壤样品内细菌、真菌、古菌等物种总DNA提取好坏及土壤对总DNA的吸附度进行鉴定，并不能获取土壤内细菌绝对数量的可靠信息。CN 106011256 A公开了一种基于实时荧光定量PCR检测小麦土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，在建立标准曲线的基础上可以对相应的特定细菌或真菌进行绝对定量，具有高度特异、灵敏、快速的特点，但其方法需要经过连接、转化，再进行qPCR扩增，需配置培养基并准备感受态细胞及提取质粒，检测步骤繁琐。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，以解决稀释平板法不能获得细菌数量的可靠信息；荧光计数法受抗褪色剂附着量和染料荧光淬灭因素影响，观察计数准确度不高；高通量测序不适宜推广以及qPCR定量检测需配置培养基并准备感受态细胞及提取质粒，检测步骤繁琐的问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，包括以下步骤：

1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；

2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；

3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增，并以标准曲线模板DNA溶液的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数；