[发明专利]一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法

权利要求书

1.一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；

2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；

3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增，并以标准曲线模板DNA溶液的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数；

4)计算待测土壤样品的目标特异性片段总拷贝数N＝10^(Ct-b)/a；

5)计算待测样品每克干土的细菌数量＝(c*V*N)/(c_r*V_r*m)；式中，c为土壤样品提取的初始DNA浓度，c_r为待测土壤样品模板DNA调整的预设浓度，V为每个土壤样品提取模板DNA的总体积，V_r为实时荧光定量PCR的扩增体系中加入的土壤样品模板DNA的体积，m为用于提取模板DNA的土壤样品干重。

2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，步骤1)中，预设浓度为4-6ng/μL。

3.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，所述模板大肠杆菌为Escherichia coli H673。

4.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，所述目标特异性片段为细菌16S rRNA基因序列。

5.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，所述标准曲线模板DNA溶液的制备方法为：根据模板大肠杆菌基因碱基数和质量及其目标特异性片段拷贝数，计算出标准曲线模板DNA母液中的目标特异性片段拷贝浓度，并取母液依次进行稀释，制得标准曲线模板DNA溶液。

6.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，

所述实时荧光定量PCR的扩增体系为：DNA模板5μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，ddH₂O补足至20μL；

所述实时荧光定量PCR的反应步骤为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火+延伸1min，30个循环。

7.根据权利要求6所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，所述上游引物的序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；所述下游引物的序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。