[发明专利]一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法

说明书

本发明提供了一种检测检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变的方法。该方法利用多重PCR‑质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。本发明的检测方法，包括以下步骤：1)针对不同耐药位点的引物设计；2)多重PCR扩增反应；3)虾碱性磷酸酶处理；4)单碱基延伸反应；5)树脂脱盐纯化；6)质谱检测。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种多重耐药位点的检测方法，特别涉及一种多重PCR-质谱检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法。

背景技术

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)是一种严重影响公共卫生的性传播病原体，全球新发感染率高达8700万例。高发病率不但加重了全球健康经济成本，更导致了严重耐药问题。伴随着淋球菌的耐药性发展和蔓延迅速，过去广泛推荐使用的抗生素(磺胺类药物、青霉素、早期头孢菌素、四环素、大环内酯和喹诺酮类药物)相继退出淋病推荐一线推荐用药。目前世界卫生组织推荐的一线经验性用药为头孢菌素联合阿奇霉素，而广谱头孢菌素类(Extended-spectrum cephalosporins，ESCs)在多个国家被认为是目前用于淋球菌感染单抗生素治疗的最后一种选择。不幸的是，近年来不断有多地报告了头孢菌素和奇耐霉素双耐药株，最近更是在英国和澳大利亚发现了超级耐药株，在阿奇霉素高耐的同时也对头孢菌素耐药，不断增长的耐药性可能会导致淋病进入一个无法治疗的时代。

淋球菌感染的治疗面临着耐药现状严重，而细菌还在不断获得新的耐药机制的困境。我们必须对其耐药性及时检测和监控，建立合适的治疗方案才能使我们对淋病的控制更加强有力。常规的淋球菌耐药性检的测方法分为培养法和非培养法，培养法测淋球菌MIC(最低抑菌浓度)是淋球菌耐药性诊断的“金标准”，特异性强，准确性高，也是唯一可以获得纯培养的分离株的方法。但这种方法需要经历繁琐费时的培养过程，缺乏时效性，且不适用于大量样本的情况。核酸扩增方法(Nucleic acid amplification tests，NAATs)具有耗时短，自动化等优点，通过检测特定耐药相关突变位点，可实现快速检测淋球菌耐药性。但是此类方法均受到方法通量的限制，且检测位点有限，无法运用于大规模样本的耐药相关位点的监测和获得全面的耐药信息。目前WGS(Whole Genome Sequencing)也成功的运用到淋球菌耐药检测中，可及时发现新的耐药相关基因以及突变，且对耐药突变位点的预测具有指导意义。但成本与技术限制了WGS在一些资源有限的地区的广泛运用，同样不适用于大规模样本的监测。因此有必要开发一种具有高通量，低成本和全面检测淋球菌耐药相关位点的多重检测方法，以进行有效的筛选。在临床治疗中，可通过一次快速的检测获得全面的耐药信息，从而选择最佳治疗方案。在而公共卫生层面，该方法一个工作人员可在8h内同时检测大量份样本，适用于大规模的淋球菌耐药监测，可及时监测不同地区不同人群中的耐药分布情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测淋球菌耐药相关位点突变的方法，该方法用于非诊断目的。该方法利用多重PCR-质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。

本发明所提供的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，是选取与五类抗生素(头孢菌素类、大环内酯类、喹诺酮类、大观霉素、青霉素类)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA。

本发明所述的19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：

1)16S rRNA C1192U

2)rpsE T24P

3)23S rRNA C2611T

4)23S rRNA A2059G

5)gyrA D95G/A

6)gyrA S91F

7)parC D86N