[发明专利]一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法

权利要求书

1.一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；

2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；

3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；

4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；

5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；

6)质谱检测：纯化后产物采用全自动点样装置点到芯片，进行分子量检测，根据分子量差异确定待测靶基因上耐药位点的基因型。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)引物设计中，19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：

1)16S rRNA C1192U

2)rpsE T24P

3)23S rRNA C2611T

4)23S rRNA A2059G

5)gyrA D95G/A

6)gyrA S91F

7)parC D86N

8)parC S88P

9)penA G542S

10)penA G545S

11)penA A501T/V

12)penA P551S/L

13)penA A311V

14)penA D345-insertion

15)ponA L421P

16)mtrR-G45D

17)mtrR-deletion A

18)porB-A121DN(G)

19)porB G120D(KNR)。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对待检测耐药位点分别设计一对扩增引物和一条延伸探针，扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.62。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的opa基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，延伸探针序列为SEQ ID NO.65。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的porA基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67，延伸探针序列为SEQ ID NO.68。