[发明专利]一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法

说明书

本发明提供一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，涉及生物检测领域，包括以下步骤：病原体富集：在1.5mL第一离心管中加入样本，于室温条件下离心5‑10min，除去上清液；宿主细胞裂解：在第一离心管中加入200‑1000μL裂解缓冲液Buffer G1，20‑40℃孵育10‑30min；宿主DNA去除：第一离心管于室温条件下离心2‑5min，除去上清液，向第一离心管中再次加入200‑500μL裂解缓冲液Buffer G1和1‑3μL全能核酸酶，30‑40℃孵育10‑30min，离心除去上清液，加入500‑1000μL Buffer G1清洗沉淀两次；微生物菌体破壁：加入100‑300μL溶菌酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于30‑40℃孵育10‑30min，涡旋混匀处理5‑10min；微生物裂解和核酸提取。本发明应用范围广，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。

背景技术

宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法，具有鉴定周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势，被越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代测序和三代测序。但在大多数的临床样本中，往往存在大量宿主DNA背景，病原体DNA只占很少的一部分。在人类微生物组计划针对不同样品类型进行的全宏基因组鸟枪法测序研究中发现，测序数据中多达99％的测序读段对应于人类基因组，因此至多只有1％的测序数据能够用于微生物物种和耐药基因鉴定。如何解决去宿主化提取是临床病原微生物宏基因组测序的关键之一。在核酸提取环节，怎样做到有效去除宿主核酸，有效富集细菌、真菌等所有病原体核酸，最大限度控制混合样品中病原微生物群落的组分检测偏差，进而提高病原体宏基因组学高通量测序技术的准确度和灵敏度，是临床宏基因组测序难点之一。

现有的去除宿主核酸的方法包括(1)基于宿主细胞与微生物大小差异或其他物理差异(如沉降速度)对宿主细胞进行清除，通常去除效率很低，无法去除游离的宿主DNA，且也会损失真菌、寄生虫和一些胞内微生物的核酸；(2)通过破坏宿主细胞膜游离宿主DNA，再通过盐依赖的HL-SAN酶降解宿主DNA，离心收集细菌为主的微生物菌体，再针对细菌DNA进行提取，通常在盐离子浓度比较高的条件下很多菌体也可能会受到损失，经过这个过程后得到的微生物核酸量往往很低；(3)基于人源细胞比微生物外壳更脆弱，使用低渗溶液、或温和的去污剂处理，仅破坏宿主细胞，使宿主DNA游离释放到溶液中，再通过离心去除上清的方法去除宿主DNA，例如一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法(CN108048450 A，广州赛哲生物科技有限公司)。由于宿主DNA是大分子高分子聚合物，具有很高的粘度，部分游离的宿主DNA可能会粘附于菌体表面，因此采用单纯的缓冲液清洗加离心去除的物理方法，并不能使游离出来的宿主DNA去除干净，导致宿主DNA残留。

此外，在微生物核酸提取环节，由于微生物种类繁多，形态各异，不同微生物细胞壁的结构和成份都不尽相同，导致其对不同破壁裂解方法存在易感性差异，因此任何一种细胞壁裂解方法制备的样品都很可能缺乏代表性，可能带来样品代表性及微生物组相对成分检测的偏差。而采用瞬时高温破壁法对菌体DNA会产生比较大的损伤，造成微生物核酸损失严重，提取量大大降低。

因此急需提供一种应用范围广，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。

本发明提供了如下的技术方案：

一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：