[发明专利]基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法

说明书

本发明公开了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，该装置不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态；无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像；通过软件控制二维扫描振镜实现透射照明和倏逝场照明方式的切换，不需要对光学系统元件进行调整，装调简单，结构紧凑，可操作性强；利用圆锥反射镜实现了对样品的全方位角照明，能够对任意照明方向的光线进行反射，同时由于反射镜光能损失小的特点，大大提高了照明的光能利用率，使得装置对照明激光的功率要求降低，更加节能环保。

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，更具体的说是涉及一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法。

背景技术

目前，在常规超分辨显微镜中，通常需要荧光标记，传统的荧光超分辨显微技术是利用荧光颗粒的非线性效应而将距离很近的结构分辨开来，达到超分辨的效果。基于荧光标记样品的超分辨成像方法对荧光颗粒和成像样品都有着较为严格的要求，普适性不强，标记样本由于其光漂白特性无法长时间成像，且易引起生物体排异反应，影响生物特性运动影响理论研究。

相比而言，非荧光标记的超分辨显微方法在活体成像、多类样品成像和快速成像等方面具有天然的优势。但是，该方法需要克服光学中衍射极限的根本性物理瓶颈，故发展非常缓慢，且现有的非荧光标记超分辨显微技术实时性差、视场狭窄，并不能很好的解决荧光超分辨显微技术普适性差、成像时间短等问题。

因此，如何提供一种无需荧光标记即可实现超分辨成像的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法，不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态，无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像，且可以实现全方位角照明，装置对照明激光的功率要求降低，更加节能环保。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置，包括：偏振照明模块、光束扫描模块以及检偏探测模块，所述偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

所述偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器、第一偏振片以及四分之一玻片；

所述光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜、扫描透镜、第一管镜、激光扩束镜、圆锥反射镜以及圆锥透镜，所述扫描透镜的工作面置于所述第一管镜的前焦面位置，经所述圆锥反射镜反射的光线与所述圆锥透镜的入射面垂直；

所述检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜、第二偏振片、第二管镜以及相机。

进一步地，所述圆锥反射镜为中空环形，所述圆锥反射镜的中心与光轴重合。

另一方面，本发明还提供了一种基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像方法，该方法包括：

步骤1：使用上述的成像装置进行照明光束扫描，在成像装置中的二维扫描振镜为无偏转状态下，即入射角θ_i＝0°时，获取垂直入射下待测样品透射光强分布图像；

步骤2：改变二维扫描振镜的偏转状态，获得某一入射角θ_i＝θ_p下的透射光场光强分布图像；

步骤3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得某一入射角θ_p下的不同照明方位角的透射光场光强分布图像集；

步骤4：继续改变二维扫描振镜的偏转状态，获得不同入射角θ_i以及不同照明方位角α_j下待测样品的透射光场光强分布图像集；