[发明专利]一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法

说明书

本发明提供了一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法，首先构建高效表达PCV2Cap和PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒：将截去核定位信号的PCV2Cap蛋白的核酸序列与PCV3Cap蛋白的核酸序连接，中间用一段疏水的柔性蛋白linker连接，在PCV2Cap和PCV3Cap序列的N端加入蜂素信号肽序列，促使其分泌表达。重组阳性杆状病毒感染sf9昆虫细胞表达的蛋白进行了多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫细胞，对脊椎动物细胞无感染性，其表达产物安全可靠，经简单处理即可用于后续试验，比传统方式更加安全有效。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）主要侵害断奶仔猪和育肥猪，可以引起多种猪圆环病毒相关性疾病，养猪业的健康发展带来巨大威胁。按照抗原性、致病性以及基因同源性的不同，将PCV划分成猪圆环病毒1型（Porcine circovirus 1，PCV1）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）以及猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 2, PCV2）三种基因型。已知PCV1无致病性，而PCV2有较强的致病性，可引起多种猪圆环病毒相关性疾病（Porcine circovirus-as sociated diseases, PCVADs），其中最主要的是断奶仔猪多系统衰弱综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS），该病在我国乃至世界猪群中广泛存在，已成为一种常见病和多发病，且多与其它病原发生混合感染，给养猪业带来了巨大损失。PCV3 感染可引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。患病母猪受孕率降低，流产率增加，生下不同胎龄的死胎、木乃伊胎；患病仔猪出现多器官系统的功能紊乱，严重影响全世界的生猪养殖业的发展。PCV2与PCV3 Cap蛋白氨基酸同源性仅为30%，两者间存在交叉免疫保护可能性较低，目前，仍没有可同时预防和控制PCV2与PCV3的疫苗和药物。因此研发一种安全有效的预防PCV2与PCV3的疫苗对预防和控制PCV的感染具有重要的意义。

目前，利用大肠杆菌优化密码子表达融合蛋白的方法较为常见。因具有培养条件简单经济、生长繁殖快速、基因改造工具及宿主种类多样等显著优势，一直作为外源蛋白表达的首选系统。但在很多实际应用过程中，其融合蛋白生产效率及产品质量随具体体系不同存在较大差异。有些体系中的蛋白表达效率低下，产物浓度低，收集和纯化困难，难以满足实际生产和应用需要；有些体系中外源蛋白虽然能高水平表达，但却形成大量无活性的包涵体，具有生物活性的可溶性蛋白有限，甚至完全检测不到活性表达，造成物质和能量的浪费。蛋白质的后续加工涉及到对无活性的包涵体蛋白进行体外复性、纯化等，但蛋白体外复性一方面增加了实际生产过程的复杂程度，另一方面其生产成本高、产量低，无法广泛地推广应用。

采用CHO细胞所生产PCV2 Cap-PCV3 Cap融合蛋白表达量高，但是也存在很多弊端。由于目前利用CHO细胞生产目的蛋白的技术水平尚不能满足生物药品的开发以及生产需求，在其上游生产中还存在诸多问题，例如：①某些糖基化表达产物不稳定、不易纯化；②重组CHO细胞上游构建与下游纯化脱节，主要表现在上游构建主要考虑其高效表达而对产物能否有效的提取出来即分离纯化考虑较少；③重组细胞培养费用昂贵。自动化水平低。目前采用CHO细胞生产PCV2 Cap-PCV3 Cap融合蛋白其表达量为0.8mg/mL，该产量是经过放大培养并优化培养条件、补料时间和补料量并经过亲和层析、生理盐水透析之后的最大产量，应用于疫苗生产中时仍存在表达量低、生产、纯化过程复杂等问题。虽然国内已有利用重组杆状病毒进行PCV2 ORF2基因的表达，表达量均在0.1-0.4mg/mL左右，重组蛋白表达量比较低成为进一步开发利用的障碍。

发明内容