[发明专利]一种基于肠道菌群的枣花花蜜导致蜜蜂毒性效应的研究方法

权利要求书

1.一种基于肠道菌群的枣花花蜜导致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：采集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，收集各组的肠道内容物，采用E.Z.N.A. stool DNA Kit试剂盒提取蜜蜂肠道粪便中的微生物DNA，以粪便DNA为模板，用带有barcode的特异引物扩增16s rDNA的V3+V4区，采用Hiseq2500 PE250测序平台进行测序，用QIIME软件对测序数据进行处理，用Uparse软件对所有样品的全部Effective Tags序列聚类，计算出每个OTU在各个样品中的Tags绝对丰度和相对信息，并进行两组样本肠道微生物之间的差异检验，明确枣花病组中上调或下调的菌属，其中：枣花病组中上调的菌属为Firmicutes与Actinobacteria；中肠和后肠中下调的菌属为Proteobacteria；枣花病蜜蜂中肠中选择性富集Fructobacillus, Gilliamella及Snodgrassell菌，而在后肠中选择性富集Lactobacillus kunkeei与Lactobacillus mellis, Bifidobacterium和Snodgrassella；枣花病病蜂肠道中的致病菌即后肠中的Xanthomonadaceae及中肠中的Escherichia_Shigella被抑制。

2.根据权利要求1所述的一种基于肠道菌群的枣花花蜜导致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）采样提取代谢物：采集患枣花病的蜜蜂，并以同期健康蜜蜂作为对照，带回实验室后收集各组的肠道内容物，采集蜜蜂肠道粪便中的微生物DNA；

（2）16s rDNA测序；

（3）对枣花病病蜂和健康对照组肠道微生物的丰度进行差异检验，明确枣花病组中上调或下调的菌属，并预测枣花花蜜导致蜜蜂毒性的代谢通路。

3.根据权利要求2所述的一种基于肠道菌群的枣花花蜜导致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：提取蜜蜂肠道粪便中的微生物DNA的具体方法为：

A、在枣花流蜜期收集已取食枣花花蜜并在蜂巢前爬行的出现枣花病症状的蜜蜂，并同时采集未取食枣花花蜜的健康蜜蜂作为对照，用纱笼迅速带回实验室；

B、在无菌条件下对采集到的健康蜂和枣花病蜂取肠道内容物，包括对照组中肠CK-M、对照组后肠CK-H、枣花病组中肠J-M及枣花病组后肠J-H各5例，每例来自一个蜂群，并且为50只蜜蜂的混合样本，每例lg；每例样本取0.5g粪便样品，采用E.Z.N.A. stool DNA Kit试剂盒提取DNA；DNA的质量和数量检测分别采用NanoDrop ND-1000分光光度计测定在260nm和280nm的吸光率以及1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

4.根据权利要求2所述的一种基于肠道菌群的枣花花蜜导致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：16s rDNA测序的具体方法为：以粪便DNA为模板，对16s rDNA进行PCR扩增和测序：从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16s rDNA的V3+V4区；引物序列为：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT；PCR扩增产物经切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量；将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序。