[发明专利]抗MRJP4的配对单克隆抗体、检测MRJP4的ELISA试剂盒和胶体金免疫试纸

说明书

本发明公开了抗MRJP4的配对单克隆抗体、检测MRJP4的ELISA试剂盒及胶体金免疫试纸。本发明以MRJP4重组蛋白为抗原采用细胞融合得到阳性细胞株，通过与其它蜂王浆主蛋白交叉反应检测获得MRJP4特异性融合细胞株，根据抗原表位配对检测进行配对初筛，根据配对结果、抗体表位检测和标准曲线绘制及样本测定等，最终确定了有较好线性关系且灵敏度高的抗MRJP4的配对单克隆抗体6H9和8C9。本发明分别构建了检测MRJP4的ELISA检测试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。本发明试剂盒特异性强，检测范围为1.563‑100ng/mL，检测灵敏度为3.758ng/mL，批内批间CV值小于10％。

技术领域

本发明涉及蜂王浆主蛋白4(MRJP4)单克隆抗体的制备及其应用，尤其涉及配对的MRJP4单克隆抗体的制备，本发明进一步涉及用所制备的配对的MRJP4单克隆抗体构建的检测MRJP4的ELISA检测试剂盒和胶体金免疫检测试纸及其在定量或定性检测MRJP4中的应用，属于MRJP4的定性和定量检测领域。

背景技术

蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆成分复杂，营养丰富，其中蛋白质含量为12.0％～15.0％。由于蜂王浆不易保存，极易变质。因而，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。目前，国际上缺少一个公认的，可以广泛推广、能如实反映蜂王浆新鲜度的方法，着也是现行蜂王浆质量标准的一个缺陷。

中国是世界蜂王浆的第一生产国和第一出口国。因此，探求和建立蜂王浆新鲜度评价方法势在必行。研究表明，蜂王浆主蛋白与蜂王浆的新鲜度呈正相关，即蜂王浆越新鲜其王浆主蛋白含量越高。MRJP4对温度非常敏感，在冷藏或室温包藏条件下，随时间的延长其浓度逐渐降低。

利用MRJP4抗原进行细胞融合方法筛选出特异性好、灵敏度高的配对的抗体对，进一步利用该配对的单克隆抗体构建出ELISA试剂盒和胶体金免疫检测试纸。ELISA检测试剂盒能实现对MRJP4绝对定量，胶体金免疫检测试纸则能在数分钟内对MRJP4蛋白实现现场快速检测，这将为蜂王浆新鲜度检测提供可靠和可实际应用的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供针对MRJP4蛋白的特异性好、灵敏度高的MRJP4单克隆抗体对；

本发明的目的之二是将所制备的一对MRJP4单克隆抗体应用于MRJP4的定性或定量检测；

本发明的目的之三提供一种定量检测检测样品中MRJP4含量的ELISA试剂盒；

本发明的目的之四提供一种定性检测样品中是否含有MRJP4的胶体金免疫检测试纸。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将MRJP4的全序列经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定SEQ ID No.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。本发明进一步将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合共12板，一共获得阳性细胞株64株；挑选其中的20株进行一亚，一亚检测后筛选出14株二亚，再经过三轮的亚克隆；经过与其它蜂王浆主蛋白的重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得9株MRJP4特异性融合细胞株，挑选了其中亲和力最高的5株进行后续抗体表位检测和配对实验，根据识别不同抗原表位的抗体配对检测进行下一步的配对初筛，最终根据识别不同抗原表位的抗体配对检测、标准曲线绘制及样本测定结果发现，6H92B8(以下简称为6H9)和8C93B10(以下简称为8C9)这对配对的抗体有较好的线性关系且灵敏度高，故最终确定6H9和8C9用于构建检测MRJP4的ELISA试剂盒以及胶体金免疫检测试纸。