[发明专利]一种基于制片法的液基真菌检测方法

权利要求书

1.一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.取样：由妇科医生用一次性采样拭子采集标本，立即放入装有保存液的标本瓶,折断模塑点并丢弃手柄拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，以进一步充分释放样品中细胞及微生物，使样品充分接触保存液；

S2.样品处理：往样品液瓶里添加等体积前处理液，拧紧瓶盖，适当振荡瓶子，使样品充分接触前处理液；

S3.样品制片：样品混合均匀后，用制片设备进行制片；制片结束后，取出载玻片，制片完成后观察，若制片中央无空心，置于空气中晾至湿干，在95％乙醇中固定5min；

S4.样品检测：在载玻片上滴加50ul荧光染色液，盖上盖玻片后静置数十秒后置于荧光显微镜下镜检；

其中，所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、PBS缓冲液100份、藻红蛋白30份和去离子水100份。

2.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤S3中所述样品制片方法包括离心法、膜式法和沉降法。

3.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述离心法包括以下步骤：利用离心将黏液与真菌细胞相分离，形成均匀的悬浮液，涂片制成单层薄片，整个过程在制片机自动完成。

4.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述膜式法包括以下步骤：将样品通过过滤膜过滤，使真菌细胞贴附在滤膜上，再通过负压力将滤膜上的真菌细胞转移到载玻片上，放入固定液中固定，整个过程在制片机自动完成。

5.根据权利要求2所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述沉降法包括以下步骤：将标本离心去上清液，转移至沉降式制片染色机待检位上，将载玻片置于染色板上，并扣上制片染色舱。

6.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤S1中所述保存液由以下原料制备而成：中药抗菌水提物2-5份、维生素C 2-7份、稳定剂1-3份、固定剂1-2份、丙三醇10-20份、乙酸适量和去离子水100-150份，所述乙酸用于调节保存液的pH值。

7.根据权利要求6所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子、板蓝根、蒲公英、柴胡、五指毛桃、连翘、贝母、苍术、兔耳草和甘青乌头；

所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500-700W微波加热提取1-2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

8.根据权利要求6所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，所述稳定剂选自MgSO₄、NaCl、MgCl₂、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种；所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤S3中所述前处理液由以下原料按重量份制备而成：冰醋酸2-5份、十二烷基磺酸钠10-15份、柠檬酸钠2-7份、三羟甲基氨基甲烷1-5份、去离子水100-150份。

10.根据权利要求1所述一种基于制片法的液基真菌检测方法，其特征在于，步骤S3中所述荧光染色液由以下原料按重量份制备而成：苯酚5-12份、乙二醇20-40份、PBS缓冲液100-200份、藻蓝蛋白或藻红蛋白30-50份和去离子水100-200份。