[发明专利]一种重组蛋白的分离纯化方法

说明书

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种重组蛋白的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含目的重组蛋白的发酵液，离心得湿菌体，经破菌、洗涤和复性等初级纯化处理，通过至少一个切向流膜过滤，酶切，再进行至少两次反相层析、除热原、超滤和装瓶步骤，获得纯度99.7％的甘精胰岛素，该方法适可有效去除内毒素、降低聚体等杂质，适合于规模化工业生产甘精胰岛素。

技术领域

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种重组蛋白的分离纯化方法。

背景技术

重组蛋白是利用重组DNA或RNA技术，在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等系统获得的蛋白质，具有疗效显著、特异性强、毒性低和副作用小等优势。目前，生物医药领域的大多数产品均为重组蛋白类产品，例如酶、重组细胞因子、Fc融合蛋白、嵌合蛋白、单克隆抗体及其衍生产品等。

大肠杆菌表达系统是目前最常用外源蛋白表达系统，具有周期短、培养成本低、代谢调控较为成熟、操作方便等优点，成为重组蛋白的首选表达系统，但大肠杆菌胞内缺乏合适的氧化还原环境，且表达速度快使得外源蛋白聚集，这些蛋白不能及时折叠，从而极易形成不可溶的包涵体。据报道，只有10％左右的哺乳动物细胞来源的蛋白在大肠杆菌系统能够获得可溶性表达，其余大部分蛋白都以包涵体形式表达。现已上市的生物药物中以大肠杆菌系统生产的产品仍主要以包涵体形式表达，包涵体的纯化及其变性、复性过程直接关系到大规模生产的效率及生产成本。

目前，重组蛋白的分离纯化主要有如下几种：a)一步法，即通过一步凝胶筛分(CN1432578A，CN 1524957A等)、一步镍离子螯合层析(CN 101050464A、CN101298476A)或一步亲和层析(CN 101921818A)获得目的产物；b)两步法，包括采用亲和层析-亲和层析法(CN109055416A)、亲和层析—阴离子交换层析两步法(US 5075423A)、亲和层析-阳离子交换层析(CN103695508B)、阴离子交换层析-疏水层析、阴离子交换层析-分子筛层析(CN101220082B)、阴离子交换层析-镍离子螯合层析法(CN1663960A)、反相层析-镍离子螯合层析法(CN1663960A)、疏水层析-羟基磷灰石柱层析、疏水层析—阳离子交换层析(US6555661B1)、阴离子交换层析-阳离子交换层析等；c)多步法，热处理—离子交换层析—乙醇沉淀三步法(US 5314993 A)、羟基磷灰石柱层析-羟基磷灰石柱层析-反相层析、热处理-活性炭吸附-二次活性炭吸附、疏水层析-离子交换层析-分子筛层析(CN 105884859A)、阴离子层析柱-氨基苯硼酸柱层析或苯基交联琼脂糖凝胶层析柱-陶瓷羟基磷灰石层析柱-阳离子层析柱(CN101970650B、CN106148302A)等。

一步分子筛纯化法，处理量小，产品纯度不高，不适宜大规模生产；利用组氨酸标签构建重组基因，并采用镍离子螯合层析纯化重组蛋白，需要在纯化过程中加入特定的酶来切除组氨酸标签，所得产品纯度低。早在1972年，Hjelm等人就提出采用IgG亲和层析的方法纯化重组蛋白：以交联琼脂糖凝胶为载体，采用溴化氰活化工艺，以IgG为功能基制成亲和层析柱纯化重组蛋白。该方法操作简单，且一步层析操作即可使纯化的重组蛋白纯度达到95％，然而，由于IgG属生物大分子，分子量大，因此为减少空间位阻，单位体积载体上只能偶联少量的IgG，造成亲和层析柱动态载量低，难以大规模生产，多用于实验室规模纯化；且偶联IgG时利用的是IgG表面大量的氨基，属于多点偶联工艺，必然导致固定化的蛋白空间取向不均一，增大了空间位阻。

发明CN1663960A公开了一种高效表达重组人胰岛素原及其类似物的新型C肽，分别使用阴离子交换层析-镍离子螯合层析法、反相层析-镍离子螯合层析法纯化甘精胰岛素，虽纯度较高，但工艺复杂。发明WO 2007/035341A1，公开了一种纯化蛋白的方法，使用过滤、渗滤、以及两步连续的层析操作，其中第一步为阴离子交换层析、疏水作用层析或陶瓷羟基磷灰石层析，第二步为阳离子交换层析，该方法同样存在操作步骤多、效率低等问题。