[发明专利]一种重组蛋白的分离纯化方法

权利要求书

1.一种重组蛋白的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下内容：将含目的重组蛋白的发酵液，离心得湿菌体，经破菌、洗涤和复性初级纯化处理，然后进行如下步骤：

A.超滤：将初级纯化样品，经装有切向流膜的过滤器过滤，得滤液，即为含目的蛋白的过滤样品；

B.使用胰蛋白酶对步骤A所得的含目的蛋白的过滤样品进行酶切，得酶切液；

C.反相层析：稀释步骤B所得的酶切液，过滤，并装载至反相层析柱上，用平衡液冲洗层析柱至基线吸光度，梯度洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；

D.反相层析：反相层析树脂柱装柱平衡后，装载步骤C所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；

E.除热原：反相层析树脂装柱平衡后，装载步骤D所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡液平衡至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含重组蛋白的流出液，经装有切向流膜的过滤器超滤浓缩，收集滤液，即为目的重组蛋白；

其中步骤C中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、80～350mM氯化钠或氯化钾与10～20％(V/V)异丙醇的混合溶液，B相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、40～180mM氯化钠或氯化钾与40～50％(V/V)异丙醇的混合溶液；

步骤D中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为5～20mM柠檬酸三钠、90～200mM硫酸铵和5～20％(V/V)乙腈的混合溶液，B相为5～20mM柠檬酸三钠、20～80mM硫酸铵和30～80％(V/V)乙腈的混合溶液；

步骤E中所述的洗脱液为0.1～0.5M氯化钠或氯化钾、20～30mM的柠檬酸三钠或乙酸铵溶液和35％-80％(V/V)的乙腈或异丙醇溶液；

所述重组蛋白为甘精胰岛素；步骤A中所述的切向流膜为再生纤维素膜或聚醚砜膜；步骤C、D、E中洗脱液的pH为3~4；步骤F中所述的切向流膜为PLC6C-C或PLCGC-C。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的切向流膜的截留分子量为10～300KD。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的胰蛋白酶为牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶，胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比为1∶400～900mg/mg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的反相层析的填料为SourceRPC。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的反相层析的填料为Source15RPC或Source 30RPC。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中所述的反相层析的填料为C8。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤D中所述的反相层析的填料为UniInsulin C8 type B、Unisil 10-120C8Ultra或Daiso SP-200-C8-10-BIO。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中所述的反相层析填料为SourceRPC。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤E中所述的反相层析填料为Source30RPC或Source 15RPC。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤F中所述的切向流膜的截留分子量为5～50KD。