[发明专利]一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法

权利要求书

1.一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）溶液提取

1）将降解材料制备成粉末或块状样品待用；

2）在所述样品中加入有机溶剂后密封浸泡，其中，有机溶剂为甲基叔丁基醚；

3）振荡所述样品和有机溶剂的浸泡溶液，并将溶液过滤后作为实验组，设双对照，分别是有机溶剂对照组和蒸馏水空白对照组；

4）将实验组和双对照组溶液分别进行旋转蒸发，水浴加热，获得实验组和双对照组的蒸馏提取溶液；

5）采用乙醇溶解蒸馏提取溶液，分别得到实验组和双对照组的实验用提取液；

（二）发芽实验

1）选取单子叶和双子叶植物种子各科至少一种进行试验，要求所用的种子大小一致、饱满度、粒径等级相同，发芽率在95%以上；

2）在相同规格的培养皿中分别加入等量的实验组和双对照组的实验用提取液，在空白组的培养皿中加入等量蒸馏水；

3）在各培养皿中排放相同数量的植物种子，盖好培养皿，放置于组培室中进行培养，每日在各培养皿中加入相同量的相应提取液，保持恒重以补充所蒸发的水分，在保持提取液质量浓度恒定条件下进行发芽培养；

（三）种子发芽率和发芽势测定

以胚根生长至种子等长作为萌发的标准，每隔一段时间记录一次发芽数，计算发芽率和发芽势；

（四）胚根指标测定

在设定时间随机选取各组相同数量的幼苗，切下胚根，测定幼苗苗高和根长，计算生物量和根苗比；

（五）物质代谢差异分析

取各组幼苗进行物质代谢差异分析，其中，物质代谢差异分析方法包括以下步骤：

1）提取：向幼苗样品中加入混合内标溶液，并加入混合提取溶液，涡旋，常温超声提取，再涡旋，离心，取上层清液于离心管中，得提取液备用；

2）吹干：用氮气吹干离心管中的提取液后，加入二氯甲烷，再次用氮气吹干离心管中的提取液；

3）反应：向离心管中加入甲氧基胺盐酸盐，封口密封后涡旋混匀，恒温金属浴40℃反应120min，冷却至室温，离心，再加入BSTFA，封口密封后涡旋混匀，恒温金属浴70℃反应90min，冷却至室温，再加入色谱纯乙腈，封口密封后涡旋混匀，恒温金属浴81℃反应90 min，冷却至室温，涡旋混匀后离心，取上层清液，得反应溶液备用；

4）检测：取所述反应溶液进样，对溶液中含有的各种物质采用气相色谱-质谱检测器进行色谱定性与定量分析；

其中，所述混合内标溶液中含有第一种内标物和第二种内标物，其中，第一种内标物由己二酸、苯基葡萄糖苷和正缬氨酸按10:4:4的体积比例混合而成，第二种内标物由甲醇与水按1:1的体积比例混合而成；所述混合提取溶液由甲醇、三氯甲烷和水按2.5:1:1的体积比例混合而成；

色谱条件为：色谱柱：HP-5 MS毛细管色谱柱，60 m × 250 μm × 0.25 μm，进样口温度：280℃；进样量：2 μL；分流比：20:1；柱流速：1.0 mL/min；升温程序：60℃保持2 min，然后以 5℃/min 升到 230 ℃保持5 min，8 ℃/min 升到 290 ℃保持23.5 min，一共运行72min；质谱条件：离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70 eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围45-600 aum，溶剂延迟：11.90 min；采集模式：全扫描采集；MS谱库：NIST08库和Willy08库；

（六）结果评估

比较实验组、双对照组植物种子的发芽率、发芽势、根苗比和生物量，同时评估实验组与对照组之间物质的差异。

2.根据权利要求1所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法，其特征在于，组培室中培养条件为：温度设定为26℃，相对湿度85%，以胚根生长至种子等长作为萌发的标准，萌发前无光照培养，萌发后光暗比16:8h，光照条件下培养14d。