[发明专利]一种花生原生质体提取方法及其应用

说明书

本发明公开了一种花生原生质体提取方法及其应用，可以使提取到的花生原生质体的完整度比例有效提高，且外源基因在所提取的原生质体中转化效率达到20％。利用本发明方法可以观察外源基因在花生原生质体中的亚细胞定位，弥补研究缺陷；同时也可以利用得到的含外源基因的花生原生质体去进行组织培养，为得到非嵌合体的转基因提供方法。另外利用本发明可以开展免疫共沉淀实验，用于筛选和确定花生的互作蛋白。

技术领域

本发明涉及植物技术领域，具体涉及一种花生原生质体提取方法及在外源基因导入花生原生质体中的应用。

背景技术

植物原生质体是去除细胞壁后由细胞质膜包裹着的裸露的细胞，其保持着植物细胞全部的细胞器和与原细胞相似的生理功能，所以可以作为一种有效快捷的多功能实验材料，其广泛用于植物分子生物学和植物细胞工程实验中。植物原生质体没有细胞壁的阻碍，易于实现外源基因的高效导入和快速表达，可作为建立基因瞬时表达体系比较理想的转化受体，而PEG法是最为常用导入外源基因于植物原生质体的方法之一。目前已在烟草(Nicotiana tabacumL.)、玉米(Zea mays L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryzasativa L.)大豆(Glycine max(L.)Merr.)等模式植物和重要作物中建立了比较成熟的原生质体瞬时表达体系^[1-4]，其中以拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系的应用最为广泛^[5]，而利用PEG诱导转化的方法将外源基因转入花生叶肉细胞原生植体中尚未有成熟的技术。刘旭等虽曾报道将外源基因AhNAC3基因导入花生原生质体，但使用其方法提取的花生原生质体易破裂且导入外源基因的转化率很低^[6]。

参考文献

[1]Koop H U,Klaus Steinmüller,Wagner H,et al.Integration of foreignsequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediatedprotoplast transformation[J].Planta,1996,199(2):193-201.

[2]Zhang Y,Su J,Duan S,et al.A highly efficient rice green tissueprotoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes[J].Plant Methods,2011,7(1):30.

[3]Lin W,Wittenbach V A.Subcellular Localization of Proteases inWheat and Corn Mesophyll Protoplasts[J].Plant physiology,1981,67(5):969-972.

[4]Rasmussen J O,Rasmussen O S.PEG mediated DNA uptake and transientGUS expression in carrot,rapeseed and soybean protoplasts[J].Plant Science,1993,89(2):199-207.

[5]史勇,金维环,刘姣姣,王林会,陈彦惠.一种改良的拟南芥原生质体的制备和转化方法[J].生物技术,2019,29(02):147-152,170.

[6]Liu X,Zhang B Y,Hong L,et al.Molecular Characterization of ArachisHypogaea NAC 2(AhNAC2)Reveals it as a NAC-Like Protein in Peanut[J].BiotechnologyBiotechnological Equipment,2010,24(4):2066-2070.