[发明专利]一种花生原生质体提取方法及其应用

权利要求书

1.一种花生原生质体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、选取2叶期花生的顶端稍微展开的嫩绿色幼叶，用镊子撕下表皮后放入装有酶解液的烧杯中，避光，置摇床中在50rpm的速度、温度26℃下酶解4h到5h；

所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、甘露醇、MES、CaCl₂、BSA；纤维素酶的质量浓度为1.5％，离析酶的质量浓度为0.75％，甘露醇的浓度为0.6mol/L，MES的浓度为10mmol/L，CaCl₂的浓度为15mmol/L，BSA的质量浓度为1％；

S2、酶解完成后，用60-100目细胞筛过滤，用W5溶液冲洗烧杯，再用60-100目细胞筛过滤，将两次的滤液合并转入离心管中，4℃，60×g离心3min；

所述W5溶液包括CaCl₂ 125mmol/L、NaCl 154mmol/L、Glucose5 mmol/L、MES 5mmol/L、KCl 5mmol/L，pH为5.8～6.0；

S3、弃上清，再加入2至3mL W5溶液洗涤混匀，离心，重复3次；然后加入新的W5溶液并混匀，于冰上静置30min；倒掉上清，加入MMG溶液至花生原生质体数2×10³/mL；所述MMG溶液包括甘露醇0.5mol/L、MgCl₂ 15mmol/L、MES 4mmol/L，pH为5.8～6.0。

2.一种将权利要求1所述花生原生质体的提取方法在外源基因导入花生原生质体中的应用，其特征在于，具体为：

(1)按照权利要求1所述方法提取花生原生质体；

(2)取100μL步骤(1)得到的花生原生质体，加入10μL携有外源基因eGFP的质粒中，轻轻吸打混匀；然后加入110μL PEG-CaCl₂溶液，轻轻吸打混匀，室温放置10min；

所述PEG-CaCl₂溶液包括甘露醇0.2mmol/L、PEG4000、CaCl₂150mmol/L；所述PEG4000的质量浓度为40％；

(3)放置在冰上，然后加入1.4mL W5溶液混匀，冰上放置1min；

所述W5溶液包括CaCl₂ 125mmol/L、NaCl 154mmol/L、Glucose 5mmol/L、MES 5mmol/L、KCl 5mmol/L，pH为5.8～6.0；

(4)在4℃下，60×g离心3min，去上清，再用200μL W5溶液混匀，离心，重复清洗3次；

(5)放置于26℃、黑暗条件下培养24h。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，携有外源基因eGFP的质粒的浓度为1000ng/μL。