[发明专利]猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白重构体及其制备方法和应用。所述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码该中和抗原表位融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分别选取PEDV、TGEV、PoRV的主要中和抗原表位基因并进行拼接，而后通过重组杆状病毒真核表达系统对串联基因进行融合蛋白表达。将表达串联基因融合蛋白的重组病毒通过腹腔注射的方式免疫小鼠，可诱导机体产生免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明为预防PEDV、TGEV、PoRV感染提供了一种新的方法，也为猪腹泻病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用。

背景技术

由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)引起的猪腹泻是严重危害养猪业的急性、高度传染性的肠道疾病。猪腹泻发病特点是严重的肠炎、呕吐和水性腹泻，特别是哺乳仔猪死亡率高，能够造成重大经济损失，成为养猪行业的一个重要问题。尽管近年来针对其研制了相应疫苗，但效果不是十分理想，而且随着病毒的遗传变异，疫苗保护效力愈发不稳，所以很长一段时间内，猪腹泻类病毒感染仍然是中国养猪业的一个不容忽视的问题。

而相关疫苗的发展也是困难重重，例如早期，研究者在体外细胞上获得PEDV是十分困难的，大多数病毒分离自小肠原代细胞感染仔猪的粪便和肠内容物后得到的。直到1988年Hofmann和WyLer才第一次有报道称PEDV能够连续在Vero细胞上进行传代培养。病毒难分离，难以传代培养，传代病毒含量低等因素的存在，使得传统疫苗的研发带来诸多挑战。

而且根据我们相关的流行病学调查得到的数据显示，猪腹泻类病毒感染多成继发感染，所以猪腹泻类病毒防治也应以联合用药为主，但目前而言随着流行毒株不断变异，所以选取保守的中和抗原表位基因片段串联进行融合蛋白的表达从而达到稳定有效的多重防治功效较为可取。然而在中和抗原表位融合蛋白的构建过程中，可能会出现蛋白表达量不高或者蛋白免疫原性不足，或者无法使猪产生较高的免疫效果，从而无法达到保护动物的目的。

就传统疫苗相对基因工程疫苗而言，传统疫苗研发有着长久的历史，大部分科研工作者也具有丰富的相关研发经验，而且研发成本可控，生产工艺成熟，传统的灭活疫苗与弱毒疫苗也在市场上历经考验，起到不可或缺的作用。但是传统疫苗生产研发应用的过程中可能伴随着病毒外源污染，病毒毒力返强等生物安全风险也是不可忽视的。人类所有的生产生活都是随着科技进步而同步提升的，基因工程疫苗必定是未来疫苗的发展趋势，随着人们对病毒感染机制了解的愈加详细和免疫保护机理的日趋明了，我们跟随着科研进展而做出相应的改进，研制新型有效的多重基因工程疫苗是疫苗研发必然的途径，市场选择的不二之选。

发明内容

本发明的目的是提供猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其基因、表达载体构建方法和应用。

本发明公开了猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明公开了编码上述猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了所述融合蛋白的重组杆状病毒表达载体，含有序列如SEQ IDNO.1所示中和抗原表位融合蛋白的基因抗原表位融合蛋白的基因。

本发明还公开了所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：

(a)获得PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7中和抗原表位基因融合蛋白重组基因片段，利用PCR方法设计3对引物如下：