[发明专利]猪三种致腹泻病毒中和抗原表位融合蛋白及其构建方法和应用

权利要求书

1.猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：

1)获得含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白重组基因片段：

利用PCR方法设计3对引物如下：

PEDV-COE-F：5'-CGGGATCCTTCTAGAAACCTTCTGAGTC-3'，

PEDV-COE-R：5'-CGGAATTCATACTTGGTACACACAT-3'，

TGEV-S-F：5'-CGGAATTCGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGATACACACATAC

CATT-3'，

TGEV-S-R：5'-CCGCTCGAGTATAACAGCTGTGGCATCT-3'，

PoRV-VP7-F：5'-CCGCTCGAGGGTTCTGGATCAGGAGGTTCTGGATCAGGACCAAATGA

AGCAGCTACAG-3'，

PoRV-VP7-R：5'-GGGGTACCGCAGCAGAATCTAAGG-3'；

并利用RT-PCR反应扩增分别得到PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7的基因片段；反应体系为：Green Taq Mix 12.5μL，cDNA 2μL，Rnase Free dH2O 9.5μL，上下游引物各1μL；PCR反应程序：95℃5min，95℃1min，61℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min；

2)获得含有PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白基因的重组表达质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7：将上述编码PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因片段PEDV-COE、TGEV-SA、PoRV-VP7连接至pFastBac-HTA载体上，得到重组表达载体pFastBacHT-COE-SA-VP7；

3)重组杆状病毒穿梭载体的构建：

将重组表达质粒pFastBacHT-COE-SA-VP7转座DH10Bac感受态细胞中，得到阳性转座子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性菌落即为能表达PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位串联基因融合蛋白的重组杆状病毒穿梭载体；

4)重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7的制备

转染Sf9细胞获得重组病毒P1，转染的前一天将处于对数生长期的Sf9细胞轻轻吹下来，向含50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的双抗及10％的FBS的2mLGrace完全培养基中加入1x10⁶个Sf9细胞;轻轻吹打细胞，使细胞均匀分布于6孔板上；28℃培养箱中培养24h；取两个1.5mL离心管内加250μL Grace培养基，然后分别在1.5mL的离心管中加入LipofectamineTM3000和5μg的pFastBac-COE-SA-VP7质粒DNA，轻轻混匀；然后将两个离心管混合均匀，室温静置15min；轻轻吸去Sf9细胞培养上清，用Grace培养基轻轻洗涤2遍；向脂质体3000-DNA复合物中补加750μLGrace培养基，轻轻混匀，并1mL/孔均匀滴加到Sf9细胞上，27℃孵育5h；吸去上清，加入2mL/孔的Grace完全培养基，28℃培养72h-120h直到细胞出现明显的病变，同时设不含rBac-COE-SA-VP7基因的BacmidDNA和空白作对照，转染过程同上，收获即为重组杆状病毒rBac-COE-SA-VP7。

2.一种编码权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白的基因，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV的中和抗原表位融合蛋白的重组杆状病毒表达载体，其特征在于，含有序列如SEQ ID NO.1所示中和抗原表位融合蛋白的基因抗原表位融合蛋白的基因。

4.权利要求1所述的猪三种致腹泻病毒PEDV、TGEV、PoRV中和抗原表位融合蛋白在制备预防由猪流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻病药物中的应用。