[发明专利]基于CRISPR技术对大肠杆菌基因进行定点突变的方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR技术对大肠杆菌基因进行定点突变的方法。本发明方法包括：利用自身的同源重组系统结合pKOV质粒，将大肠杆菌基因组中靶基因替换为抗性标记基因，得到重组大肠杆菌；利用CRISPR/Cas9系统和λ‑Red同源重组系统，将重组大肠杆菌基因组中的抗性标记基因替换为带有突变位点的靶基因。本发明建立了一种高效、简单的将大肠杆菌传统基因编辑技术与CRISPR系统相结合的靶基因定点突变方法。该过程建立的重组质粒pSGKP‑km‑spacer，可以应用于其它靶基因的定点突变。一方面，大大缩短了实验操作；另一方面，为后续实现大量靶基因定点突变研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于CRISPR技术对大肠杆菌基因进行点突变的方法。

背景技术

目前对大肠杆菌进行染色体水平上靶基因的改造有如下两种方法：一是利用其自身RecA同源重组系统编码的重组蛋白介导DNA发生同源重组；二是通过引入外源重组酶λ-Red或RecET提高同源重组效率。上述两种均是通过DNA分子发生双交换实现对靶基因的编辑。这些传统的大肠杆菌同源重组技术通常需要外源性辅助质粒以及筛选标记基因，对靶基因进行敲除及插入等实验操作，但当对靶基因进行点突变等更加精准的操作时，这些重组技术存在重组效率低、流程繁琐等缺点，想要大规模应用仍然面临巨大的挑战。

CRISPR/Cas系统改造的碱基编辑器，是目前对核酸碱基进行点突变应用较为广泛的方法，作为一种新型基因编辑工具，该技术仍存在脱靶率高、编辑窗口局限等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种将大肠杆菌传统的基因编辑技术与CRISPR-Cas9技术相结合，快速、高效的实现大肠杆菌靶基因定点突变的方法。

第一方面，本发明要求保护一种对大肠杆菌基因组中靶基因进行定点突变的方法。

本发明所要求保护的对大肠杆菌基因组中靶基因进行定点突变的方法，可包括如下步骤：

(A)利用自身所携带的同源重组系统将大肠杆菌基因组中靶基因替换为抗性标记基因，得到所述靶基因被敲除同时带有所述抗性标记基因的重组大肠杆菌；

(B)利用CRISPR/Cas9系统和λ-Red同源重组系统，将(A)中所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因。

在步骤(A)中，所述重组大肠杆菌可按照包括如下步骤的方法获得：将重组载体A导入大肠杆菌感受态细胞，经培养、筛选获得所述重组大肠杆菌。

所述重组载体A为含有DNA片段A的重组质粒；所述DNA片段A自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、所述抗性标记基因，以及所述靶基因的下游同源臂。

进一步地，所述重组载体A为将所述DNA片段A克隆到pKOV质粒中后所得。

更进一步地，所述重组载体A为将pKOV质粒的NotI和BamHI酶切位点之间的小片段替换为所述DNA片段A后所得的重组质粒。

在步骤(B)中，利用CRISPR/Cas9系统和λ-Red同源重组系统，将所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因，可通过向所述重组大肠杆菌中导入重组载体B和载体C来实现。

所述重组载体B为含有DNA片段B1和DNA片段B2的重组质粒；所述DNA片段B1为针对所述抗性标记基因的sgRNA识别区域序列(即间隔序列spacer对应的编码序列)；所述DNA片段B2自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、带有所述突变位点的所述靶基因，以及所述靶基因的下游同源臂。

所述载体C为用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶的质粒。

进一步地，所述重组载体B为将所述DNA片段B1和所述DNA片段B2克隆到pSGKP-km质粒后所得。