[发明专利]基于CRISPR技术对大肠杆菌基因进行定点突变的方法

权利要求书

1.一种对大肠杆菌基因组中靶基因进行定点突变的方法，包括如下步骤：

(A)利用自身所携带的同源重组系统将大肠杆菌基因组中靶基因替换为抗性标记基因，得到重组大肠杆菌；

(B)利用CRISPR/Cas9系统和λ-Red同源重组系统，将(A)中所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述重组大肠杆菌是按照包括如下步骤的方法获得的：将重组载体A导入大肠杆菌感受态细胞，经培养、筛选获得所述重组大肠杆菌；

所述重组载体A为含有DNA片段A的重组质粒；所述DNA片段A自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、所述抗性标记基因，以及所述靶基因的下游同源臂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组载体A为将所述DNA片段A克隆到pKOV质粒中后所得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组载体A为将pKOV质粒的NotⅠ和BamHⅠ酶切位点之间的小片段替换为所述DNA片段A后所得的重组质粒。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(B)中，利用CRISPR/Cas9系统和λ-Red同源重组系统，将所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因，是通过向所述重组大肠杆菌中导入重组载体B和载体C实现的；

所述重组载体B为含有DNA片段B1和DNA片段B2的重组质粒；所述DNA片段B1为针对所述抗性标记基因的gRNA识别区域序列；所述DNA片段B2自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、带有所述突变位点的所述靶基因，以及所述靶基因的下游同源臂；

所述载体C为用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶的质粒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组载体B为将所述DNA片段B1和所述DNA片段B2克隆到pSGKP-km质粒后所得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组载体B为在pSGKP-km质粒的两个BsaⅠ酶切位点之间插入所述DNA片段B1，使用BamHⅠ单酶切之后，连接所述DNA片段B2后所得的重组质粒；

所述载体C为pCasKP-apr质粒。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述抗性标记基因为氨苄青霉素抗性基因。

9.如下任一物质：

(I)成套载体I，由权利要求2-8任一中的所述重组载体A、所述重组载体B和所述载体C组成；

(II)成套载体II，由权利要求2-8任一中的所述重组载体A和所述重组载体B组成；

(III)成套载体III，由权利要求2-8任一中的所述重组载体A和重组载体B’组成；所述重组载体B’将权利要求2-8任一中的所述重组载体B中的所述DNA片段B2删除后所得的重组质粒；

(IV)载体IV，为权利要求2-8任一中的所述重组载体B或(III)中所述的重组载体B’；

(V)试剂盒，含有大肠杆菌，以及所述(I)至所述(IV)中任一。

10.权利要求9所述物质在对大肠杆菌基因组中靶基因进行定点突变中的应用。