[发明专利]一种发光细菌冻干粉试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种发光细菌冻干粉试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将菌种冻干粉复苏，接种培养，得到发光细菌菌液，将发光细菌菌液稀释256倍后检测，发光量为w；

步骤2：将zmL所述发光细菌菌液进行冷冻离心，得到菌体；按公式(1)、(2)调整离心所用的发光细菌菌液体积z：

y＝0.00000006x²-0.0044x+1000000 (1)

z＝y÷w (2)

其中，x为发光细菌冻干粉试剂盒产品的初始发光量，x为10万至1000万中任一数值，w为发光细菌菌液256倍稀释后检测得到的发光量；

步骤3：将菌体与10～100mL保护剂混合，得到菌体混合液；所述保护剂由0.001～0.05g/mL精氨酸、浓度为pg/mL的脱脂奶粉、0.01～0.05g/mL氯化钠、0.05～0.3g/mL淀粉、0.05～0.3g/mL D-山梨醇、0.01～0.05g/mL维生素E和水组成；脱脂奶粉的浓度p值由公式(3)、(4)得到：

p＝m×z÷3.5 (4)

其中，n为试剂盒正控值，z为离心所用的发光细菌菌液体积；

步骤4：将菌体混合液进行真空冷冻干燥，得到发光细菌冻干粉；

步骤5：步骤4所得发光细菌冻干粉、稀释液、渗透压调节液、质控标准物质溶液组成发光细菌冻干粉试剂盒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述复苏为：将菌种冻干粉与0～6℃培养液混合，静置5～15min；以g/mL计，所述菌种冻干粉与培养液的比例为0.2：(0.5～4)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述接种培养为：以0.2g菌种冻干粉/100mL培养液的比例计，将复苏菌液接种于培养液中，在20℃条件下震荡培养24h；以5mL菌液/100mL培养液的比例进行转接，继续培养24h，得到发光细菌菌液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述冷冻离心的条件为：2～5℃，5000～10000rpm，5～20min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述真空冷冻干燥为：在-80℃预冻3～8h，再在-80℃真空冷冻干燥15～40h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述稀释液为1w/v％～5w/v％NaCl溶液，所述渗透压调节液为11w/v％～55w/v％NaCl溶液。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述质控标准物质溶液为2～3mg/L Zn²⁺溶液。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述菌种冻干粉的制备方法为：

步骤1-1：将发光细菌甘油管解冻；

步骤1-2：将甘油管中菌种接种于培养液，在20℃震荡培养24h，之后转接一次，继续培养24h后得到发光细菌菌液；所述菌液8倍稀释后的OD₆₀₀＞0.250，256倍稀释后检测得到的发光量＞80W；

步骤1-3：发光细菌菌液在2～5℃、5000～10000rpm条件下离心5～20min，得到菌体；

步骤1-4：以离心的发光细菌菌液体积计，将菌体与保护剂以(100～5000)：(10～100)的体积比混合，得到菌体混合液；所述保护剂由0.001～0.05g/mL精氨酸、浓度为0.001～0.05g/mL的脱脂奶粉、0.01～0.05g/mL氯化钠、0.05～0.3g/mL淀粉、0.05～0.3g/mL D-山梨醇、0.01～0.05g/mL维生素E和水组成；

步骤1-5：将菌体混合液进行真空冷冻干燥，得到菌种冻干粉。

9.权利要求1至8中任一项所述制备方法制得的发光细菌冻干粉试剂盒。