[发明专利]一种由甘蔗发状根诱导成苗的组织培养快繁方法

说明书

本发明公开了一种由甘蔗发状根诱导成苗的组织培养快繁方法。该方法依次包括以下步骤：(1)甘蔗茎尖的获取和接种：于连续晴朗的艳阳天上午9:00‑10:00，砍下成熟的甘蔗茎尖段，剥离外层组织，取幼嫩茎尖，进行接种；(2)外植体诱导发状根；(3)发状根诱导愈伤组织；(4)愈伤组织诱导成苗。在上述步骤中采用了不同成分及配比的培养基。采用本发明的方法，能够快速地获得甘蔗无菌苗，利于产业化生产。采用本发明的方法，甘蔗发状根诱导率高达99％、愈伤组织诱导率达到17％、成苗率达58％。

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种甘蔗的组织培养快繁方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)为禾本科甘蔗属植物，作为重要的糖料作物，全世界的蔗糖产量约75％产自甘蔗，而在中国则占90％以上。我国的主产蔗区主要分布在北纬24°以南的热带、亚热带地区，包括广东、台湾、广西、福建、四川、云南、江西、贵州、湖南、浙江、湖北、海南等南方12个省、自治区。目前，在生产中甘蔗采用蔗茎芽循环留种，存在易造成病菌积累、繁殖率低、繁殖周期长等缺点，因此，为获得甘蔗优良种质资源，建立甘蔗的组培快繁体系是实现甘蔗产业化生产有效途径。

发状根是发根农杆菌侵染植物细胞后诱导植物细胞产生，具有遗传性状稳定、生长迅速、离体培养简单等优点，但若农杆菌侵染时间把握不准、清除不干净也易产生污染问题。邵明成、韩晓玲、崔红本等人的研究相继发现胡萝卜、小冠花和烟草的发状根皆可在合适的培养基上完成植株再生。油菜素内酯(Brassinolide，BL)是第六大植物生长激素，极低的BL处理也能充分激发植物内在潜能，促进作物生长、增加作物产量、增强作物抗逆性和提高作物的抗病力。有关BL应用于甘蔗组织培养的研究鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种繁殖效率高、遗传稳定性好、不受季节环境限制的甘蔗组织培养快繁方法。

本发明所提供的甘蔗组织培养快繁方法，是由甘蔗发状根诱导成苗的快速繁殖方法，依次包括下述步骤：

1)外植体诱导发状根

以甘蔗茎尖为外植体，在发状根诱导培养基中进行培养，获得甘蔗发状根；

2)发状根诱导愈伤组织

将所述甘蔗发状根转接至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，获得甘蔗愈伤组织；

3)愈伤组织诱导成苗

将所述愈伤组织切成1-2cm的小块，接种到成苗培养基中进行成苗诱导，获得甘蔗无菌幼苗。

上述方法步骤1)中，所述甘蔗茎尖具体可按照下述方法获取得到的：于连续晴朗的艳阳天上午9:00-10:00，砍下成熟的甘蔗茎尖段，剥离外层组织，于超净工作台中取幼嫩茎尖。所述甘蔗茎尖在使用前，需截去头尾段，并切成1-2cm小段。

上述方法步骤1)中，所述发状根诱导培养基为含0.2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L灵发素的MS基本培养基，其中，所述MS基本培养基中蔗糖浓度为25g/L，琼脂添加量为6g/L，pH值为6.4。

本发明所述发状根诱导培养基是向蔗糖浓度为25g/L，琼脂添加量为6g/L，pH为6.4的MS基本培养基中添加0.2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.2mg/L灵发素得到的。

所述发状根诱导培养基在使用前需进行灭菌，灭菌条件可为：121℃下灭菌20min。

所述培养的条件为：先置于黑暗条件下培养11-14d，培养温度为(26±2)℃；随后转入光照培养阶段培养18-23d，光照周期设置为12h光/12h暗，光照强度28-30瓦，培养温度为(26±2)℃。

作为优选方案：所述步骤1)在接种完茎段后于黑暗中培养11d后再转入光照培养。