[发明专利]同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法

说明书

一种同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT‑PCR检测方法，通过对甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的特异性引物，以及特异性引物浓度、酶用量和退火温度等的优化，建立了通过一次RT‑PCR反应能使3种病原的反转录和PCR扩增在同一反应管中，同一反应条件下一步同时完成的多重RT‑PCR检测方法，操作步骤简单，避免了常规RT‑PCR的重复检测或两步法多重RT‑PCR反应步骤、程序比较复杂、耗时长、交叉污染。该方法具有简便、高效、特异性强，灵敏度高等特点，可用于甘蔗脱毒健康种苗的生产和应用、种质交换和引种检疫，对防控甘蔗花叶病的扩散蔓延具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测甘蔗花叶病的甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法。

背景技术

甘蔗是我国最重要的糖料作物，其产糖量占全国总产糖量的85％以上，在农业经济收入中占有重要的地位。甘蔗花叶病是由病毒引起的世界性甘蔗“癌症”，导致感病植株品质变劣，种苗萌芽率下降、分蘖减少，蔗糖结晶率下降，感染率达30％以上时产量损失30％～50％，蔗糖分下降6％～14％，已成为我国蔗区分布最广、危害最严重的病害之一，每年造成数以亿计的经济损失，严重制约了我国蔗糖产业的持续稳定发展。目前国际上还没有防治甘蔗花叶病的有效药剂，因此，有针对性地进行隔离检疫、筛选抗病品种，或培育无毒种苗等是防控甘蔗花叶病的重要措施，而对种苗及植株进行快速准确的病毒检测显得尤为重要。

甘蔗花叶病病原复杂，可由多种病毒引起。我国蔗区已确定的甘蔗花叶病病原主要有甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)3种。这3种病原病毒所引起的症状表现非常相似，常常存在复合侵染或交叉感染现象，仅通过症状表现很难准确区分三种病原，而准确区分三种病原有助于针对性地进行抗病育种，选育不同病毒病原的抗性品种；同时也可以对不同病毒病原在各个地区的发生危害进行准确监测，实现品种合理布局，为制定科学有效的甘蔗花叶病防控措施提供依据；还可以适时监测甘蔗脱毒健康种苗、进出口种质带毒情况，为甘蔗产业的安全生产提供保障，因此，必须通过基因检测的方法进行准确诊断。

基因检测是从核酸水平检测病毒，其检测的灵敏度和特异性均高于血清学检测，特别适用于准确性要求高的样本检测。目前甘蔗病毒的基因检测方法主要有PCR、RT-PCR和环介导等温扩增技术等，其中常规RT-PCR是目前应用最广泛的RNA病毒检测方法，但常规RT-PCR一次只能对单一病毒进行检测。对于田间常以两种或两种以上病原复合侵染发生的甘蔗花叶病，利用常规RT-PCR进行病原检测，则需要进行2次或3次的RT-PCR，操作步骤繁琐，且使用试剂种类多，成本高，检测一个样品至少需8h才能出结果，耗时长、检测效率低，不能满足现代生产的需要。现有的多重RT-PCR检测多采用两步法，需要在两个反应体系中完成病原的检测，反应步骤、程序比较复杂、耗时长、易造成交叉污染。

随着甘蔗脱毒健康种苗在甘蔗生产上的运用，迫切需要一种更为快速、准确、高通量的甘蔗花叶病病原检测方法，目前未见同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、准确、特异性的同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法，以简化操作、减少工作量、提高效率。