[发明专利]同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法

权利要求书

1.同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法，3种甘蔗花叶病病原为甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒，其特征在于：

所述一步法多重RT-PCR检测方法中采用甘蔗线条花叶病毒引物检测甘蔗线条花叶病毒，所述甘蔗线条花叶病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物组成，目的片段长度为800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花叶病毒引物检测高粱花叶病毒，所述高粱花叶病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物组成，目的片段长度为450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花叶病毒引物检测甘蔗花叶病毒，所述甘蔗花叶病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物组成，目的片段长度为200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；

检测结果判定为：

当检测样品扩增到800bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗线条花叶病毒阳性；若无800bp条带，则为甘蔗线条花叶病毒阴性；

当检测样品扩增到450bp大小的单一条带时，该样品为高粱花叶病毒阳性；若无450bp条带，则为高粱花叶病毒阴性；

当检测样品扩增到200bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗花叶病毒阳性；若无200bp条带，则为甘蔗花叶病毒阴性；

当检测样品同时扩增到上述三条条带、或同时扩增到上述任意两条条带，则该样品感染了对应的病毒。

2.根据权利要求1所述的一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于：20μL一步法多重RT-PCR反应体系中有灭菌ddH₂O 8.4μL，2×1Step Buffer 8.0μL，5U/μL PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.8μL，20μmoL/L SCSMV上、下游引物各0.25μL，20μmol/L SrMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上、下游引物各0.25μL，RNA模板1.0μL；一步法多重RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性5min；然后94℃变性30s，62℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至12℃结束反应。

3.采用一步法多重RT-PCR检测方法同时检测甘蔗花叶病3种病原的特异性引物组，其特征在于：由甘蔗线条花叶病毒引物、高粱花叶病毒引物和甘蔗花叶病毒引物组成，甘蔗线条花叶病毒引物用于检测甘蔗线条花叶病毒，所述甘蔗线条花叶病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物组成，目的片段长度为800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花叶病毒引物用于检测高粱花叶病毒，所述高粱花叶病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物组成，目的片段长度为450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花叶病毒引物用于检测甘蔗花叶病毒，所述甘蔗花叶病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物组成，目的片段长度为200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.一种同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的采用一步法多重RT-PCR检测方法同时检测甘蔗花叶病3种病原的特异性引物组，所述甘蔗花叶病3种病原为甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒。