[发明专利]鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒感染与免疫的荧光定量PCR检测试剂、检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明针对非洲猪瘟CD2v和荧光蛋白eGFP设计了特异的引物、探针。通过与P72基因联合组成ASFVP72/CD2v双重荧光PCR检测方法或ASFVP72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法可以检测非洲猪瘟感染，同时可以鉴别非洲猪瘟病毒野生株和CD2v基因缺失重组疫苗株，从而将感染动物同被免疫过的动物区分开来。本发明具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，为疫情检测及疫病防控提供了重要的监测手段。

技术领域

本发明涉及一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒感染与免疫的荧光定量PCR检测试剂、检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室检测确诊。

该病于1921年在非洲的肯尼亚首次出现，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家和地区发生、扩散和流行，2018年8月3日，中国确诊了首例非洲猪瘟疫情，截至目前中国已先后发生140多起疫情，给中国的生猪产业造成巨大经济损失，导致猪肉价格急剧攀升，中国的非洲猪瘟疫情防控形势也十分严峻。

非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，是一种包膜病毒，具有二十面体形态，该病毒主要在巨噬细胞的细胞质中复制，也是唯一由节肢动物传播的DNA病毒。非洲猪瘟病毒(ASFV)的基因组大小为170-190Kb，可以编码150-200种蛋白质，这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。其中P72蛋白是非洲猪瘟病毒的一种主要衣壳结构蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％，是一种非常保守的抗原性蛋白，对自然感染具有免疫原性。P72基因是目前最常用的基因分型靶序列，但各个亚型的P72基因序列高度同源，只有个别位点发生变异，因此，该基因同样也是建立ASFV快速核酸检测方法的理想靶序列。从ASFV报道至今已有近百年的历史，但ASFV具有庞大的基因组，可编码大量的蛋白质参与逃避宿主的防御系统，并且在现阶段对ASFV的保护性免疫仍然知之甚少，导致目前为止没有研发出有效的疫苗。但目前通过与自然弱毒株基因组序列的比较和分析等方法已经确认了几种基因与免疫抑制有关，包括CD2V、MGF、9GL等。这其中研究较多的是MGF和CD2v基因，已有研究者构建了MGF、CD2v单基因缺失和二者的双基因缺失重组病毒，动物安全性和免疫效果试验结果表明，MGF基因单缺失和MGF、CD2v双基因缺失毒株对免疫猪均具有良好的安全性和很好的攻毒保护效果。其中在基因缺失重组病毒的构建过程中采用了eGFP这类绿色荧光蛋白来进行功能定位，便于研究。eGFP、eYFP、eCFP等标签蛋白均为增强型荧光蛋白，可与目的蛋白一起在真核表达系统中融合表达，不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针，广泛应用于基因表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。此外，上述荧光蛋白在转染细胞的确定、动态监测细胞间分子交流、免疫分析等方面具有广泛的应用。

鉴于中国当前的ASF疫情形势以及国外非洲猪瘟疫情净化根除的历史来看，疫苗防控是我国当前防控非洲猪瘟疫情最为有效迫切的方法，根据目前的研究进展，不久的将来便会有基因缺失疫苗上市启用，但是当这些基因缺失疫苗上市启用之后，又会带来新的ASFV防控困扰，如何能够准确的鉴定猪体内的抗体是由野毒株感染引起的还是疫苗株免疫引起的，将会成为ASFV防控工作的重中之重。

发明内容