[发明专利]牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及检测试纸条

说明书

本发明提供了一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法及试剂盒，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒提供了牛、鸭特异性RPA标记引物和探针组合，其序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3和SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示。本发明试剂盒还提供了一种检测试纸条，可针对RPA扩增产物进行多重检测。采用本发明的RPA引物探针组合分别扩增样品DNA，通过试纸条对扩增产物进行检测，可判定样品中是否含有牛、鸭源性成分。本发明建立的检测方法灵敏度高，特异性强，无需特殊设备，且反应时间仅需30min。本发明为牛源性、鸭源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、特异性强的特点，且适用于现场检测。

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测试纸条。

背景技术

随着人民生活水平的逐步提高，人们对肉品的消费量日益增加，肉类价格差异也逐步拉大，低价肉冒充高价肉的现象越来越常见。目前，国内外市场上在牛肉制品的生产与销售中，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者的事件屡屡出现。其中，用低廉的鸭肉伪造牛肉是目前主要的掺假手段。这种掺假行为不仅涉及营养价值和食品安全等问题，还会严重侵犯消费者合法权益。因此肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点问题之一，而对肉制品的来源进行鉴定并建立快速简便的检测方法就显得尤为重要。

现有技术中对于动物源性成分的鉴定主要采用的是基于DNA的核酸检测法，其中运用最为广泛的是常规PCR检测技术，但是PCR检测技术需要依赖精密的仪器和繁琐的实验程序，基层实验室及商场质量检测部门难以使用，并且该方法需要专业人员来操作，从而限制了该技术的广泛应用，使之难以实现大规模普及推广，难以达到现场检测的要求。

近年来，核酸恒温扩增技术得到了快速发展，与传统PCR相比，核酸等温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。重组酶聚合酶介导等温扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA动态解链，同时在重组酶介导下引物与模板正确配对形成复合体，然后DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA链。其最大的特点是不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，只需在39℃恒温反应30分钟即可完成对模板核酸的扩增。

由于RPA方法与传统PCR方法有着极大的差异，其对引物和探针有更高的要求，是影响RPA方法的关键，不同的引物直接影响扩增速度和检测灵敏度，从而影响现场检测，并且目前没有专门的RPA引物设计软件。因此，RPA的引物设计难度较大。到目前为止，尚没有针对牛源性、鸭源性成分现场快速检测方面的产品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供牛源性、鸭源性成分现场快速检测试纸条，利用生物素和FITC分别标记RPA下游引物和探针的5’端，通过试纸条检测能快速鉴别源性成分，具有高度专一性，灵敏度高，检测速度快等特点，并且结果可通过肉眼判读，非常适用于现场检测。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行牛和鸭基因组特异DNA序列的筛选。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，并在RPA反应体系中引入一条探针，长约 50个碱基，在其5’端标记FITC，探针的中间设计一个脱碱基位点，大肠杆菌核酸外切酶nfo可以识别该位点并切开磷酸二酯键，产生自由的羟基端，DNA 聚合酶便可在此进行延伸，并且RPA反向引物的5’端标记生物素，最终得到双标记扩增产物。本发明还专门设计组装了针对双标记核酸扩增产物进行检测的试纸条，试纸条的金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，检测线吸附有生物素抗体，质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

本发明还提供如下技术方案：

一种牛源性、鸭源性成分现场快速检测方法的RPA引物及探针组合；

对牛基因组特异DNA序列扩增的RPA引物和探针组合，具体为：